这篇文档属于类型a，是一篇关于骨组织工程中供体差异和生物性别对软骨-骨转化机制影响的原创研究。以下是详细的学术报告：

作者及机构
本研究由Isaak Decoene（第一作者）、Hanna Svitina、Mohamed Belal Hamed、Anastassios Economou、Steve Stegen、Frank P. Luyten和通讯作者Ioannis Papantoniou共同完成。研究团队主要来自比利时鲁汶大学（KU Leuven）的骨骼生物学与工程研究中心（Skeletal Biology and Engineering Research Center）和Prometheus骨骼组织工程转化部门，部分合作者来自埃及国家研究中心（National Research Centre）和希腊研究与技术基金会（Foundation for Research and Technology–Hellas）。研究发表于期刊《Bone Research》（2025年，第13卷，第41期），DOI: 10.1038/s41413-025-00418-z。

学术背景
骨组织工程领域面临临床转化的关键挑战：缺乏能够预测植入物再生能力的非侵入性生物质量指标，且供体差异（如生物性别）对骨修复机制的影响尚不明确。本研究基于“发育工程”（developmental engineering）理念，通过模拟骨折愈合中的软骨-骨转化路径，利用人类骨膜来源细胞（human periosteum-derived cells, hPDCs）构建“愈伤组织类器官”（callus organoids），旨在揭示供体差异和性别对骨形成的影响，并鉴定与骨修复能力相关的分泌蛋白标志物。

研究流程
1. 类器官构建与分化
- 样本来源：从12名健康供体（6男6女，年龄16-29岁）获取骨膜活检样本，分离hPDCs并扩增至第7代。
- 类器官形成：使用AggreWell 800微孔板（非粘附性）培养，通过重力自组装形成类器官（每孔1,000细胞）。
- 软骨分化：分为两组：（1）未分化对照组（5例，3男2女）；（2）软骨分化组（10例，5男5女），培养基含BMP2、GDF5、TGF-β1等生长因子。分化周期21天，定期更换培养基。

1. 形态与功能分析

   • 时间序列成像：通过亮场显微镜追踪类器官大小和透明度变化，发现男性供体类器官体积显著增大，女性则保持较小且致密。
     
   • 组织学染色：阿尔新蓝（Alcian blue）和番红O（Safranin-O）染色显示，男性供体类器官形成肥大软骨（hypertrophic cartilage, HyC），女性则多为纤维软骨（fibrocartilage, FiC）。
     
   • 免疫组化：检测胶原II（Col2）、胶原I（Col1）、Indian Hedgehog（IHH）和Osterix（OSX），证实HyC类器官具有软骨成熟和矿化标志物。
     

2. 转录组与分泌组分析

   • 转录组测序：通过RNA-seq鉴定差异表达基因（DEGs）。HyC和FiC类器官共有570个共同上调基因（如SOX9、TGFβ3），与骨骼发育和ECM重塑相关；HyC特异性表达IHH、LOXL2等矿化相关基因，FiC则高表达弹性纤维基因（如ELN）。
     
   • 分泌蛋白质组：采用LC-MS/MS分析条件培养基，鉴定1,589种蛋白质。HyC特异性分泌整合素结合唾液蛋白（IBSP）和血管生成素样因子（ANGPTL2），FiC特异性分泌SRPX2（一种硫酸软骨素蛋白聚糖）。
     

3. 体内骨形成评估

   • 组装体植入：将600个类器官组装成“assembloids”，植入裸鼠皮下4周。
     
   • Micro-CT与组织学：85%的植入体形成骨小梁，HyC组矿化体积更大，但FiC组同样完成软骨-骨转化。免疫荧光显示HyC组中人类细胞（mitochondria+）更多参与骨小梁形成。
     

主要结果
1. 供体性别决定分化路径：男性供体倾向形成HyC（肥大软骨），女性则倾向FiC（纤维软骨），差异源于早期增殖阶段（男性细胞数量7天内激增）。
2. 共同分泌蛋白标志物：无论分化路径，骨形成类器官均分泌84种共同蛋白（如骨桥蛋白SPP1、基质金属蛋白酶MMP13），与血管生成和ECM重塑相关。
3. 功能等效性：HyC和FiC类器官在体内均能形成骨组织，但HyC效率更高（体积更大）。

结论与价值
1. 科学意义：首次揭示人类骨膜类器官存在性别依赖的分化路径，挑战了“肥大软骨为骨化唯一模板”的传统认知。
2. 应用价值：分泌蛋白质组（如ANGPTL4、PDGFA）可作为非侵入性质量标志物，指导个性化骨植入物的临床生产。
3. 转化潜力：为开发性别适配的分化协议（如添加激素或生长因子）提供依据，推动组织工程产品的标准化。

研究亮点
1. 创新模型：首次建立人源骨膜类器官系统，模拟骨折愈合的供体差异。
2. 多组学整合：结合转录组和分泌组，鉴定出与体内骨形成直接相关的生物标志物。
3. 性别差异机制：发现早期增殖动力学是决定分化路径的关键，为性别医学在骨修复中的应用奠定基础。

其他价值
研究提出的“发育工程”框架（如类器官组装技术）可扩展至其他组织工程领域，如软骨或血管化组织构建。此外，分泌组分析策略为其他细胞治疗产品的质量控制提供了范式。