这是一项关于核受体NR4A1在心肌缺血再灌注损伤中作用机制的基础研究，由广州中医药大学的Chun Li、中国人民解放军总医院第六医学中心的Ying Zhang以及中国中医科学院广安门医院的Xing Chang作为共同通讯作者领导完成。Junyan Wang、Haowen Zhuang和Lianqun Jia为共同第一作者。该研究于2024年8月19日发表于International Journal of Biological Sciences（《国际生物科学杂志》）。

这项研究聚焦于心血管疾病领域的核心难题——心肌缺血/再灌注损伤。心肌梗死等缺血性心脏病在恢复血液供应后，常会引发二次损伤，即再灌注损伤，其关键病理机制是线粒体功能障碍。在正常情况下，细胞通过线粒体质量控制体系，包括线粒体分裂、融合及线粒体自噬，来清除受损的线粒体并维持其稳态。已有研究表明，孤儿核受体NR4A1可感知外界压力并加剧心肌损伤，但其是否通过调控线粒体分裂与自噬的交互作用来介导损伤，此前尚不明确。因此，本研究旨在阐明NR4A1在心肌缺血再灌注损伤中，通过调控线粒体分裂因子和FUN14结构域蛋白1介导的线粒体自噬，进而导致线粒体碎裂和广泛性凋亡的具体分子机制。

为达成研究目标，团队设计了严密的体内外实验流程。首先，研究者构建了心肌缺血/再灌注的小鼠模型和体外心肌细胞缺氧/复氧模型。在体内实验部分，他们使用了野生型C57BL/6小鼠，并创新性地构建了心肌特异性NR4A1基因敲除小鼠和NR4A1转基因小鼠，以及FUNDC1基因敲除和转基因小鼠。通过结扎并松解左前降支冠状动脉，模拟了45分钟缺血后再灌注的过程，并在术后通过心脏病理染色、超声心动图评估心功能、酶联免疫吸附试验检测炎症因子水平，以及透射电镜观察线粒体超微结构，全面评估了心脏损伤程度和线粒体形态。体外实验则分离了新生小鼠心肌细胞并培养HL-1细胞系，通过缺氧培养后恢复氧供应的方式模拟缺血再灌注损伤，并利用腺病毒载体进行基因干预。

在明确了NR4A1的致病作用后，研究进入了机制验证的核心阶段。首先，为全面揭示NR4A1调控的下游通路，研究者对NR4A1基因修饰小鼠的缺血再灌注模型进行了第二代转录组测序。数据分析显示，NR4A1介导的损伤与线粒体分裂融合、线粒体自噬、线粒体未折叠蛋白反应、生物合成及氧化磷酸化等通路密切相关。基于此，研究者开展了一系列挽救实验来确定NR4A1与线粒体分裂因子和FUN14结构域蛋白1的因果关系。他们利用蛋白质印迹法和免疫荧光共定位等技术，检测了在不同基因背景下，线粒体分裂驱动蛋白、线粒体自噬标志物LC3与线粒体外膜转位酶20的共定位，以及泛凋亡通路相关蛋白的表达变化。此外，研究还通过分子对接模拟预测了NR4A1与线粒体分裂因子蛋白间的相互作用。为了进一步区分线粒体分裂和线粒体自噬在损伤中的主次关系，团队设计了复杂的基因交互干预实验，即在NR4A1基因敲除或过表达的背景下，分别敲低或过表达线粒体分裂因子和FUN14结构域蛋白1，并观察其对线粒体呼吸链复合物活性、线粒体膜通透性转换孔开放程度、线粒体生物合成相关转录因子以及细胞骨架蛋白的影响。

研究结果显示，NR4A1是心肌缺血再灌注损伤的关键正向调控因子。首先，在野生型小鼠中，缺血再灌注损伤后心肌组织NR4A1蛋白表达随时间显著上调，伴随心肌纤维结构破坏、心功能下降、炎症反应加剧和线粒体碎裂。相比之下，心肌特异性敲除NR4A1的小鼠表现出显著的抵抗性，这些病理指标均有明显改善；而心肌特异性过表达NR4A1则未见保护作用。这从正反两方面证实了NR4A1的致病作用。其次，在机制上，研究明确了NR4A1同时调控两条导致线粒体稳态失衡的信号通路。一方面，缺血再灌注损伤诱导的NR4A1激活了线粒体分裂因子介导的线粒体病理性分裂。数据显示，损伤后线粒体分裂因子蛋白表达升高，并伴随线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的活化，而促进线粒体融合的OPA1和MFN1/2蛋白表达则受抑制。敲除NR4A1或使用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1，均能逆转这种过度分裂。另一方面，NR4A1抑制了FUN14结构域蛋白1介导的线粒体自噬。研究发现，损伤后FUN14结构域蛋白1相关的自噬流被阻断，导致受损线粒体无法被及时清除而大量堆积。过表达FUN14结构域蛋白1或敲除NR4A1能恢复线粒体自噬水平，而沉默FUN14结构域蛋白1则抵消了NR4A1敲除带来的保护效应，这确立了NR4A1对FUN14结构域蛋白1的上游负调控关系。值得注意的是，恢复FUN14结构域蛋白1的功能或抑制线粒体分裂，均可阻断下游的级联损伤反应，包括缓解线粒体未折叠蛋白的过度应激、恢复线粒体呼吸链复合物的活性、保护细胞骨架蛋白的完整性，并最终抑制由坏死性凋亡、铁死亡和细胞焦亡组成的“泛凋亡”通路的激活。

本研究的结论是，NR4A1是心肌缺血再灌注损伤中的一个全新且关键的负性调控靶点，其病理机制在于通过同时激活线粒体分裂因子相关的线粒体分裂并抑制FUN14结构域蛋白1介导的线粒体自噬，从而破坏线粒体质量控制网络的平衡，导致心肌细胞发生泛凋亡。该研究的科学价值在于，它首次系统地阐明了NR4A1通过协同调控线粒体分裂因子介导的线粒体分裂与FUN14结构域蛋白1依赖的线粒体自噬，这种交叉对话机制在缺血再灌注损伤中的核心作用，为理解线粒体稳态失衡的分子病理网络提供了新见解。在应用价值方面，研究指出了靶向调控NR4A1-线粒体分裂因子-FUN14结构域蛋白1信号轴的平衡，是未来治疗缺血性心脏病、减轻再灌注损伤的一个具有巨大潜力的策略。

本研究的突出亮点在于：其一，发现了NR4A1作为上游分子，对线粒体分裂和线粒体自噬这两个关键质量控制过程进行同步反向调控的独特机制，揭示了其在损伤中的核心整合作用。其二，研究将下游的多种细胞死亡形式归纳为泛凋亡，并将线粒体分裂、自噬功能障碍与泛凋亡的激活逻辑清晰地串联起来。其三，实验设计严谨，大量使用了多种心肌特异性基因修饰动物模型和复杂的基因交互干预实验，从多维度、多层次确证了NR4A1-线粒体分裂因子-FUN14结构域蛋白1信号轴的功能，其论证过程具有很强的说服力。此外，研究中提及的线粒体未折叠蛋白反应和线粒体生物合成受阻，也丰富了读者对于缺血再灌注损伤中线粒体蛋白稳态调控的认识。