该文档属于类型a，是一篇关于拉沙病毒（Lassa virus, LASV）糖蛋白介导膜融合机制的原始研究论文。该研究由Uriel Bulow、Ramesh Govindan和James B. Munro共同完成，主要作者来自美国塔夫茨大学医学院分子生物学与微生物学系以及马萨诸塞大学医学院微生物学与生理系统系、生物化学与分子药理学系。论文发表于2020年7月2日的《Viruses》期刊上。
拉沙病毒是流行于西非地区的拉沙出血热的病原体，被美国疾病控制与预防中心列为A类优先病原体。该病毒通过其包膜糖蛋白（glycoprotein, GP）介导病毒包膜与靶细胞内体膜的融合，从而完成病毒进入细胞的过程。已有研究表明，拉沙病毒进入细胞需要内体的酸化环境，并涉及至少两个细胞受体：α-肌营养不良聚糖（α-dystroglycan, αDG）和溶酶体相关膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP1）。在病毒进入过程中，GP在细胞表面先与αDG结合，病毒随后通过巨胞饮作用进入内体；随着晚期内体酸化，GP发生从αDG到LAMP1的亲和力转换。前期研究已经发现酸性pH足以引发GP1的构象变化，但对于酸性pH是否足以独立触发GP介导的膜融合、LAMP1是否必需等问题仍不明确。本研究旨在直接证明酸性pH单独即可触发拉沙病毒GP介导的膜融合，并系统评估LAMP1在该过程中的作用。
研究的工作流程主要包含四个实验环节。第一个环节是病毒灭活实验，用以测定拉沙病毒GP的pH敏感性。研究者利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的水疱性口炎病毒（VSV）假病毒系统，在其表面展示拉沙病毒Josiah株的GP，并以表达流感病毒H5血凝素（HA）假病毒作为已知酸性pH触发融合的阳性对照，以表达禽白血病病毒包膜糖蛋白（ALV Env）假病毒作为酸性pH不触发融合的阴性对照。假病毒在不同pH缓冲液和不同温度下孵育5分钟或30分钟后恢复到中性pH，再感染Vero细胞，通过流式细胞术检测GFP表达来评估感染性。结果显示，21°C时pH 5.0孵育5分钟仅导致约13%的感染性下降，而37°C时pH 5.5孵育5分钟感染性下降至45%，pH 5.0时下降90%；孵育30分钟时pH 5.5即可导致90%的感染性丧失。在冰上孵育时任何pH均不导致感染性丧失，表明该过程是温度依赖和不可逆的。
第二个环节是用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测中和抗体对暴露于酸性pH后的GP的识别能力。研究所用的中和抗体12.1F、37.2D和37.7H可识别桥接GP1和GP2的抗原表位，因而能特异性识别GP的融合前构象。在37°C、pH 5.0孵育30分钟后，这些中和抗体的结合能力分别下降约50%、60%和75%，而在冰上孵育则无此变化。非中和抗体26.5E和24.6C在所有pH和温度条件下均保持与GP的结合。这一结果进一步证实酸性pH在生理温度下触发了GP从融合前构象向非融合前构象的不可逆转变。
第三个环节是单颗粒脂质混合实验，用于直接观察GP介导的膜融合过程。这是本研究中最关键的技术创新。研究者构建了一个基于石英微流体室的平面支撑脂双层系统，在脂双层中掺入pH敏感的6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein, CF）作为pH指示剂，以及Gd1a神经节苷脂用于结合病毒粒子。病毒粒子表面的VSV核心同时表达了GP和被改造为不能介导膜融合的HA0蛋白，HA0通过与脂双层中的唾液酸结合使病毒粒子附着于脂双层，从而将GP介导的膜融合与受体结合事件解耦。病毒包膜用亲脂性荧光染料DiD标记，浓度足以使其荧光被部分淬灭。当病毒膜与平面脂双层发生半融合（hemifusion）时，DiD扩散进入脂双层，荧光迅速增强，从而实现对单个病毒粒子脂质混合事件的实时观测。实验采用棱镜型全内反射荧光显微镜（prism-based TIRF microscopy）进行成像，以100毫秒曝光时间、10赫兹频率记录至少3分钟。数据分析通过提取CF荧光下降50%与DiD荧光增强之间的时间间隔，将这些与时间间隔的分布直方图拟合为伽马分布（gamma distribution），从而得到速率常数k和决定步骤数n，进而计算平均脂质混合时间。该方法在流感病毒、西尼罗病毒、猫冠状病毒和VSV等病毒的膜融合研究中已有应用，在本研究中被适配用于拉沙病毒GP的研究。
第四个环节是探究LAMP1对脂质混合动力学的影响。研究者将可溶性LAMP1通过其多聚组氨酸标签固定在含有Ni-NTA脂质的平面脂双层上，使用不含HA0的VSV-GP假病毒进行单颗粒脂质混合实验。实验在pH 5.5和5.0条件下进行，并设置无LAMP1的对照。
研究的主要结果如下：在无LAMP1的情况下，pH 4.0时平均脂质混合时间为13.5±0.5秒，速率常数为0.31±0.01秒⁻¹，决定步骤数约为4.2±0.1；pH升至4.5和5.0时，速率常数分别降至0.25±0.01和0.19±0.02秒⁻¹，平均脂质混合时间相应增加，但决定步骤数始终保持在约4。pH高于5.0时在观测时间窗内未观察到脂质混合事件，pH低于4.0时事件发生过快而无法准确评估。在预先于酸性pH和37°C下孵育的假病毒中，即使再次暴露于酸性缓冲液也不发生脂质混合，缺乏GP而仅含HA0的病毒粒子结合于脂双层但不发生膜融合，表明观察到的现象确实由GP介导。在存在LAMP1的情况下，pH 5.0时出现了快速脂质混合，其速率常数和平均脂质混合时间与无LAMP1时pH 4.0的结果相当，相当于LAMP1的存在使触发pH提高了一个单位。决定步骤数在LAMP1存在时仍约为4.1±0.1，与无LAMP1时一致。预先在酸性pH下孵育的假病毒在LAMP1存在时同样丧失脂质混合能力。
这些结果共同支持以下结论：酸性pH在生理温度下足以触发拉沙病毒GP从融合前构象转变为融合后构象，并引发不可逆的膜融合过程；在这一过程中，LAMP1并非必需，但可通过降低融合的活化能而显著提高脂质混合的动力学效率，使融合在更温和的酸性条件下发生。该研究具有重要的科学价值，因为它直接证实了酸性pH独立触发拉沙病毒GP介导膜融合的能力，并澄清了LAMP1在该过程中的具体角色，即作为辅助因子而非必需受体。从应用价值来看，该研究为理解拉沙病毒进入细胞的分子机制提供了关键证据，为抗病毒药物和中和抗体的研发提供了理论依据，特别是针对GP构象变化这一关键步骤的干预靶点。研究的亮点在于建立了一个能够直接观察单颗粒病毒脂质混合事件的实验平台，将GP介导的膜融合与受体结合解耦，从而能够在精确控制的pH条件下定量分析融合动力学。此外，研究通过伽马分布拟合揭示了膜融合过程中存在约4个连续的速率决定步骤，这一发现暗示了GP在融合过程中可能需要经历多个中间构象状态，或者需要多个GP三聚体的协同作用才能完成膜融合。