人源多能干细胞高效分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞的研究报告

第一作者及机构
本研究由Christoph Patsch（瑞士罗氏制药研发中心）、Ludivine Challet-Meylan（哈佛大学干细胞与再生生物学系）等来自罗氏制药、哈佛大学、麻省总医院等机构的联合团队完成，于2015年8月发表于《Nature Cell Biology》（DOI:10.1038/ncb3205）。通讯作者为Christoph Patsch和Chad A. Cowan。

学术背景

研究领域与动机
该研究属于干细胞分化与血管生物学交叉领域。人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）具有无限增殖和分化为所有体细胞类型的潜力，但此前缺乏高效、可重复的血管细胞分化方案。血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）和平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管的主要功能单元，其体外高效分化对疾病建模（如动脉粥样硬化）和再生医学至关重要。

科学问题
传统分化方法（如拟胚体形成法）效率低（1%-5%）、耗时长（10-15天），且依赖非标准化条件。本研究旨在开发一种化学定义明确的单层培养方案，实现hPSCs在6天内高效（>80%）分化为功能成熟的ECs和VSMCs。

研究流程与实验设计

1. 中胚层诱导与Wnt信号激活

• 实验对象：hPSCs（包括hESC系HUES9、SA001和iPSC系BJ-RiPS）。
  
• 关键步骤：
  
  • GSK3抑制剂筛选：通过激酶结合实验和TCF/LEF荧光素酶报告系统，评估CP21、CHIR-99021等化合物的选择性和Wnt信号激活能力。CP21和CHIR-99021被确认为高效GSK3β抑制剂（IC50分别为1 nM和6 μM）。
    
  • 中胚层定向：联合GSK3抑制剂（CP21或CHIR）与BMP4处理hPSCs，3天内诱导中胚层标志物（如Brachyury/T）表达上调，同时下调多能性基因（OCT4）。免疫荧光和qPCR证实β-连环蛋白（β-catenin）积累及下游靶基因（AXIN2、SP5）激活。
    

2. 血管细胞定向分化

• 内皮细胞分化：中胚层细胞经VEGF和Forskolin（激活cAMP-PKA通路）处理2天，后续VEGF单独培养4天。流式细胞术显示CD144+ ECs效率达61.8%-88.8%（n=10），表达KDR、CD31等标志物，且无造血标记（CD43/CD45）。
  
• 平滑肌细胞分化：改用Activin和PDGF-BB诱导，6天内获得95.4% CD140b+ VSMCs（n=16），表达SMA、Myosin IIB等收缩蛋白。
  
• 纯化技术：通过CD144磁珠分选（MACS）获得纯度>95%的ECs，VSMCs因高纯度无需额外纯化。
  

3. 功能验证与多组学分析

• 转录组学：PCA分析显示hPSC-ECs/VSMCs与原代细胞（如HUVECs、UASMCs）高度相似（相关系数r=0.93和0.88）。基因集富集分析（GSEA）证实ECs富集于血管发育（GO:0001568），VSMCs富集于细胞外基质组织（GO:0030198）。
  
• 代谢组学：LC-MS检测66种代谢物，hPSC-ECs与原代ECs代谢谱Spearman相关性达0.98。
  
• 功能实验：
  
  • ECs：形成单层屏障（TEER值与HUVECs相当），响应凝血酶和炎症因子（TNF-α上调ICAM1介导HL60细胞黏附）。
    
  • VSMCs：收缩实验显示对Endothelin-1和Carbachol的钙响应，3D胶原收缩模型证实U46619诱导的收缩能力。
    
• 体内实验：将hPSC-ECs与间充质干细胞（MSCs）或hPSC-VSMCs共移植至NOD-SCID小鼠，14天后形成含红细胞的功能性血管网络（CD31+染色）。
  

主要结果与逻辑链条

1. GSK3抑制+BMP4高效诱导中胚层：CP21/CHIR通过稳定β-catenin激活Wnt信号，与BMP4协同上调中胚层基因（如MIXL1），为后续血管分化奠定基础。
   
2. 细胞因子定向分化：VEGF或PDGF-BB分别驱动中胚层向ECs或VSMCs分化，效率显著优于传统方法。
   
3. 功能成熟性验证：转录组、代谢组和功能实验证实hPSC衍生细胞与原代细胞高度相似，且具备体内成血管能力。
   

研究结论与价值

科学意义
- 首次在化学定义条件下实现hPSCs的快速、高效血管分化，揭示了Wnt/BMP信号在血管谱系决定中的核心作用。
- 为心血管疾病建模（如动脉粥样硬化）提供了可扩展的细胞来源。

应用价值
- 支持高通量药物筛选（如抗血管生成药物测试），推动再生医学中血管化组织的构建。

研究亮点

1. 高效性：6天内获得>80%目标细胞，产量达每百万hPSCs产出2500-3000万血管细胞。
   
2. 标准化方案：完全化学定义的单层培养体系，避免了传统方法的批次差异。
   
3. 多维度验证：结合转录组、代谢组和功能实验，全面证实细胞成熟度。
   

其他价值
- 公开了详细实验方案（DOI:10.1038/protex.2015.055/056），促进方法推广。
- 为研究血管发育和疾病机制提供了新工具。