主要作者及发表信息
本项开创性研究由茅台学院食品科学与工程系的刘旭东、浙江海洋大学海洋水产国家工程研究中心的杨超、加拿大滑铁卢大学化学工程系及纳米技术研究所的张磊，以及南华大学公共卫生学院典型环境污染与健康危害湖南省重点实验室的曹毅等学者共同完成。刘旭东和杨超为本文的共同第一作者，张磊和曹毅为共同通讯作者。该研究成果于2022年8月3日在环境科学与生态学领域的顶级期刊《Science of the Total Environment》上在线发表。
研究背景与目的
石墨烯基纳米材料，特别是氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO），在环境保护、电子设备、食品包装以及生物医学（如药物递送、生物成像）等领域展现出巨大的应用潜力，这导致人体接触GO的风险日益增加。已有研究表明，GO能够穿透血脑屏障（Blood Brain Barrier, BBB）并在实验动物脑部积聚，因此其对中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的潜在神经毒性引发了广泛关注。大脑是富含脂质的器官，维持脂质稳态（Lipid Homeostasis）对于神经元的正常功能至关重要。虽然已有二维（2D）细胞培养和动物模型的研究指出GO暴露可能干扰神经细胞的脂质稳态并引起脂质过氧化，但2D培养缺乏三维结构，而动物大脑与人类大脑存在显著差异，这些模型均无法准确反映GO对人脑的真实影响。因此，本研究旨在利用一种更先进、更能模拟人脑复杂结构和生理环境的三维（3D）人脑类器官（3D Human Brain Organoids）模型，系统性地探究GO对脂质稳态的毒性作用及其具体分子机制。
详细研究流程与实验方法
本研究的工作流程可概括为模型构建与表征、毒性筛查、机制探索和多组学验证四个主要环节。
1. 3D人脑类器官模型的构建与GO材料表征 研究者首先将人诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）分化为神经前体细胞，随后经过90天的分化培养，生成了直径约为1.5毫米的结构均一的3D大脑类器官。该模型此前已被证实能表达人类皮层的多种标志蛋白，如TBR1、BRN2、SATB2和CTIP2，能较好地重现人类大脑皮层的细胞组成。实验所用的GO从商业途径购得，研究人员利用原子力显微镜（AFM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）等一系列表征手段，确认GO样品为具有片层结构的少层氧化石墨烯纳米片，其水动力学尺寸约为585纳米，zeta电位约为-44.4毫伏。
2. 细胞毒性评估与转录组学分析 为确定GO的毒性剂量，研究人员将3D脑类器官分别暴露于0、12.5和50 μg/mL的GO中24小时。通过吖啶橙/4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（AO/DAPI）双染法评估细胞活性，结果显示50 μg/mL的GO暴露导致细胞活性显著下降至83.4%。基于此浓度，研究者收集了对照组和暴露组各10个脑类器官的总RNA，进行了转录组测序（RNA-sequencing）。测序采用Illumina NovaSeq™ 6000平台，数据分析时，将表达差异倍数大于2或小于0.5且调整后P值小于0.05的基因定义为差异表达基因，并基于基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes, KEGG）通路进行富集分析，以系统性地探究GO毒性的潜在分子通路。
3. 脂质组学分析与内质网应激的角色验证 转录组学数据提示GO影响了脂质代谢通路，为验证这一发现，研究团队进行了非靶向脂质组学（Untargeted Lipidomics）分析。他们将3D脑类器官分为四组：对照组、12.5 μg/mL GO组、50 μg/mL GO组，以及为探究内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress）作用的联合暴露组（50 μg/mL GO + 5 mM 4-苯基丁酸，即ER Stress抑制剂4-Phenylbutyric Acid, 4-PBA）。每组使用4个脑类器官提取总脂质，通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术进行脂质谱检测与分析。此外，为从蛋白水平验证ER Stress通路是否被激活，研究人员采用蛋白质印迹法（Western Blotting）检测了各组脑类器官中ER Stress的标志蛋白，包括葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、肌醇需求激酶1α（IRE1α）及其下游的X-盒结合蛋白1（XBP-1）。实验中还检测了胞内超氧阴离子的水平，以评估GO是否通过氧化应激介导其毒性。
主要研究结果与数据支持
研究结果表明，GO暴露对3D人脑类器官产生了显著的多层次影响。
1. 转录组学揭示基因表达与代谢通路紊乱 RNA测序数据显示，50 μg/mL的GO处理导致了201个基因的显著差异表达（80个上调，121个下调）。GO富集分析显示，与细胞死亡/凋亡相关的多条GO术语被显著改变，这从分子层面印证了细胞毒性结果。最为关键的发现是，GO暴露显著改变了多条与脂质运输和代谢相关的GO术语，例如“胆固醇输入调节（Regulation of Cholesterol Import）”、“酰基辅酶A脱氢酶参与的脂肪酸β氧化负调控”和“胆固醇外排调节（Regulation of Cholesterol Efflux）”。同时，KEGG通路分析也显示，甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid Metabolism）、甘油酯代谢（Glycerolipid Metabolism）等脂质分子合成代谢通路虽未达统计学显著性，但已被GO暴露所扰动。除了脂质代谢，GO还影响了线粒体和内质网（ER）相关的大量基因功能。
2. 脂质组学证实GO呈剂量依赖性改变脂质谱 脂质组学数据有力地支持了转录组学的发现。在3D脑类器官中共鉴定出12个脂质类别。GO暴露导致其中6个脂质类别（如神经酰胺Ceramide，CER；溶血磷脂酰丝氨酸Lysophosphatidylserine, LPS；磷脂酸Phosphatidic Acid, PA）的含量呈剂量依赖性上调，而其他脂质类别则下调或不变。特别值得注意的是，所有7种被鉴定出的神经酰胺（CER）分子的水平均随GO浓度的升高而上升，表明GO暴露可能导致具有脂毒性的神经酰胺蓄积。当加入ER Stress抑制剂4-PBA与GO联合暴露时，相较于单独暴露GO的处理组，大多数被GO上调的脂质类别（包括所有CER分子）的增量都出现了下降，这初步证实了ER Stress在GO诱导的脂质紊乱中扮演核心角色。
3. 内质网应激IRE1α/XBP-1轴是核心作用机制 机制探索揭示了GO扰乱脂质稳态的清晰信号通路。首先，GO暴露并未显著诱导细胞内超氧阴离子的产生，排除了氧化应激是此模型中脂毒性的主要原因。其次，转录组学数据显示，GO暴露特异性激活了ER Stress的三条经典信号分支之一：IRE1α通路，而对PERK和ATF6分支的影响较小。蛋白质印迹实验进一步从蛋白水平验证了这一发现：50 μg/mL GO暴露显著上调了GRP78、IRE1α和XBP-1的蛋白表达水平。而ER Stress抑制剂4-PBA的加入，能部分或完全抑制由GO引起的这些蛋白水平升高，具体表现为：4-PBA部分降低了GRP78，完全抑制了IRE1α的升高，并显著减弱了XBP-1的上调。这一系列证据链完美地证明了“直接接触GO → 激活GRP78/IRE1α/XBP-1轴引发的ER Stress → 破坏脂质稳态（尤其是神经酰胺蓄积）”这一毒性作用通路。
结论与研究价值
本研究成功利用3D人脑类器官作为体外模型，结合转录组学和脂质组学的多组学联合分析方法，首次深入揭示了氧化石墨烯（GO）对人脑组织的神经毒性新机制。研究的核心结论是，GO通过直接接触，诱导人脑细胞产生内质网应激，特别是通过激活IRE1α/XBP-1信号轴，最终导致脂质代谢紊乱和脂毒性脂质（如神经酰胺）的异常积累，该过程不依赖于传统的氧化应激机制。
本研究的科学价值在于，它证实了在纳米毒理学研究中采用3D人类细胞模型替代传统2D培养和动物模型的必要性与优越性，因为3D模型更能准确模拟人体组织的复杂生理环境和真实反应。其应用价值在于为评估GO等新兴纳米材料的神经生物安全性提供了关键的理论依据和可靠的研究范式。这一发现警示我们，即使在没有氧化损伤的直接证据下，GO也能通过干扰核心细胞器（如内质网）的功能来引发严重的代谢毒理学后果。
研究亮点
本研究的亮点主要体现在三个方面。第一，发现创新性：首次明确提出了GO通过“非氧化应激依赖”的内质网应激通路扰乱脂质稳态的新机制，纠正了此前过分强调氧化应激介导GO毒性的认知。第二，方法先进性：创新性地将3D人脑类器官模型与多组学（转录组学靶向通路筛选+脂质组学靶向代谢验证）技术相结合，形成了一套从宏观基因表达筛选到微观脂质指纹验证，再到核心机制蛋白确证的系统性研究策略，逻辑链条清晰完整。第三，研究对象的特殊性：选用的人iPSC来源的3D大脑皮层类器官，能表达人脑皮层层级标志物，极大程度地还原了人类大脑的组织结构和细胞复杂性，使得研究结果相较于动物或2D细胞模型更具人类相关性，为未来精准评估神经毒性提供了重要工具。