基于荷兰型脑淀粉样血管病患者来源脑类器官构建新型体外疾病模型的研究报告

本研究由来自荷兰莱顿大学医学中心人类遗传学系的 Elena Daoutsali, Barry A. Pepers, Stavros Stamatakis, Linda M. van der Graaf, David A. Parfitt, Ronald A. M. Buijsen 和 Willeke M. C. van Roon-Mom，以及该中心神经学系的 Gisela M. Terwindt 共同完成。研究论文以“荷兰型脑淀粉样血管病患者脑类器官中的β淀粉样蛋白积累和增强的神经元分化”为题，于2023年1月17日发表在《衰老神经科学前沿》（*Frontiers in Aging Neuroscience*）期刊上。

一、 研究的学术背景 本研究属于神经退行性疾病与干细胞疾病模型交叉领域，聚焦于一种罕见的遗传性脑部疾病——荷兰型脑淀粉样血管病（Dutch-type cerebral amyloid angiopathy, D-CAA）。D-CAA由淀粉样前体蛋白基因发生点突变引起，该突变位于β淀粉样蛋白结构域内，导致Aβ（尤其是Aβ40）肽易于寡聚和纤维化，并损害其通过脑血管的清除，最终在软脑膜动脉和皮层小动脉周围异常积累，引起血管平滑肌细胞变性，导致患者在40至65岁之间发生致命的脑内出血。

目前，针对D-Caa病理机制研究和治疗开发面临重大挑战：缺乏能够再现疾病关键特征的体外细胞模型（如过表达细胞模型未显示明显表型），且可用的动物模型（如转基因小鼠和大鼠）数量有限，并且存在物种差异和病理发展缓慢等问题。诱导多能干细胞技术的出现为建立患者特异性疾病模型提供了新途径。大脑是一个复杂的三维结构，而脑类器官作为一种三维培养系统，能够模拟大脑的多种细胞类型和区域结构，已被成功用于模拟阿尔茨海默病等多种神经退行性疾病。然而，传统脑类器官缺乏血管系统，这限制了其在研究D-CAA这类血管病变中的应用价值评估。

基于此，本研究旨在探索利用D-Caa患者来源的iPSCs构建脑类器官模型的可能性。研究团队前期的研究发现，在神经元分化的D-Caa iPSCs中并未检测到Aβ40和Aβ42肽产量的增加，这与某些阿尔茨海默病模型不同。因此，他们提出假说：D-CAA的关键病理可能在于Aβ的正常产生，但突变导致其更易于聚集。本研究的目标是验证这一假说，并系统评估D-CAA脑类器官是否能够重现疾病相关的病理变化，如Aβ积累、以及潜在的细胞与分子水平异常，从而为D-CAA提供一个有价值的新型体外研究平台。

二、 详细研究流程 本研究流程复杂且系统，主要包含以下关键步骤：

1. iPSC细胞系的建立与质量控制：

   • 研究对象：研究使用了4个D-Caa患者来源的iPSC系（包括两个新重编程的系D-CAA 1和2，以及一个之前已建立的系D-CAA 3）和4个对照iPSC系（包括一个通过CRISPR/Cas9基因编辑从对照细胞系创建的等基因配对对照系D-CAAiso，及其同源对照Control-iso，以及其他两个对照系）。
   • 处理与方法：从两名D-CAA患者获取皮肤活检样本，培养成纤维细胞后，使用商业重编程试剂盒将其重编程为iPSCs。对于等基因对的创建，研究人员设计了靶向APP基因突变位点附近的单导RNA，通过电转将CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合体与单链DNA同源定向修复模板导入对照iPSCs，随后通过液滴数字PCR和Sanger测序筛选并确认成功引入点突变的单克隆细胞系。
   • 质量控制实验：对所有iPSC系进行了一系列严格的质量验证，包括：形态学观察；免疫荧光染色检测多能性标志物；qRT-PCR分析多能性基因表达；全球筛查阵列分析染色体异常和身份确认；Sanger测序验证荷兰突变的存在；以及通过自发分化三胚层（检测SOX17、SMA、PAX6）验证其多向分化潜能。

2. 脑类器官的生成与优化：

   • 研究对象：使用上述所有iPSC系生成脑类器官。
   • 处理与方法：研究首先比较了两种不同的脑类器官培养方案：基于Lancaster等人方法的商业试剂盒（Stemcell Technologies）和Gabriel等人的方案。通过观察不同时间点的形态、测量大小以及使用免疫荧光分析神经元和前脑标志物，评估两种方案的效率和可重复性。最终选择了在神经上皮芽形成、大小均一性和皮质板结构再现方面表现更稳定、变异更小的商业试剂盒方案用于后续所有实验。

3. 脑类器官的表型表征与时间点分析：

   • 研究对象：在培养的第52天和第110天两个时间点，收集对照和D-Caa组的脑类器官进行后续分析。每个细胞系在每个时间点分析3个生物重复类器官。
   • 处理与方法：
     • 形态与大小监测：在整个培养过程中定期拍摄明场图像，并使用ImageJ软件量化类器官面积。
     • 免疫荧光分析：收集的类器官经固定、蔗糖脱水、OCT包埋后，冷冻切片。对切片进行多重免疫荧光染色，使用的抗体靶向多种细胞类型和病理标志物，包括：前脑神经元标志物FOXG1；紧密连接蛋白ZO-1（指示脑室样结构）；神经前体细胞标志物PAX6；深层皮层神经元标志物CTIP2；神经元标志物βTubIII和MAP2；星形胶质细胞标志物GFAP；小胶质细胞标志物Iba1；全长APP蛋白（Y188抗体）；Aβ蛋白（4G8和6E10抗体）；以及磷酸化Tau蛋白。使用共聚焦显微镜和全玻片扫描系统进行成像分析。
     • Aβ积累量化：对所有类器官切片中4G8抗体阳性的Aβ聚集进行计数和统计分析。
     • 靶向基因表达分析：从每个类器官中提取总RNA，反转录为cDNA。使用Fluidigm高通量qRT-PCR平台，对一个包含42个基因的面板进行表达分析。这些基因覆盖了神经前体细胞、神经元（包括不同亚型和成熟度）、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、以及D-CAA相关通路基因。数据分析时，根据基因表达水平高低，分别选用不同的内参基因组合进行归一化，并采用多重t检验进行统计分析。

4. 数据分析流程：

   • 形态学数据（类器官大小）和免疫荧光定量数据（Aβ积累数量）使用GraphPad Prism软件进行统计分析，比较组间差异。
   • Fluidigm qRT-PCR获得的原始Cq值经过内参基因校正后，进行组间（对照 vs. D-CAA）和组内跨时间点（D52 vs. D110）的比较，采用多重t检验结合Bonferroni校正。

三、 主要研究结果 1. 成功构建了高质量的D-Caa患者来源及等基因iPSC模型：新重编程的D-Caa iPSC系和通过CRISPR/Cas9编辑创建的等基因D-Caa系均通过了所有质量控制测试，表现出典型的多能性特征和正确的基因型，为后续研究提供了遗传背景清晰且可靠的细胞材料。

1. D-Caa脑类器官在早期即出现Aβ积累：

   • 免疫荧光染色结果显示，在培养仅52天时，D-Caa脑类器官中即可检测到明显的4G8和6E10抗体阳性的Aβ聚集，而对照组中此类聚集非常少见。
   • 对总共188个类器官切片的定量分析证实，D-Caa组在D52和D110两个时间点的Aβ积累数量均显著高于对照组。这一发现有力地支持了研究假设，即D-Caa突变导致Aβ在生理表达水平下即易于聚集，且这种聚集表型在无血管系统的三维脑类器官中也能快速出现。

2. D-Caa脑类器官表现出增强的神经元分化和前脑特性：

   • 靶向基因表达分析揭示了显著的神经发育变化。在D52时，D-Caa类器官中神经前体细胞标志物如SOX1、SOX2、PAX6的表达水平显著高于对照。与此一致，前脑神经元决定基因FOXG1和BF1，以及成熟神经元标志物MAP2和谷氨酸能神经元标志物VGLUT1的表达也在D-CAA组中显著上调。
   • 免疫荧光染色进一步支持了这一结果，显示D-CAA类器官在D52时往往具有更清晰、更典型的皮质板分层结构。
   • 这些结果表明，D-Caa突变可能影响了早期脑发育过程中的神经元命运决定和分化程序，导致了更早或更强的神经元（尤其是前脑神经元）生成。

3. 星形胶质细胞相关基因表达上调并与Aβ积累共定位：

   • 基因表达分析显示，在D110时，D-Caa类器官中星形胶质细胞标志物GFAP和水通道蛋白AQP4的表达显著高于对照，且GFAP的表达随培养时间显著增加。
   • 免疫荧光共定位分析发现，绝大多数（约90%）的Aβ积累都被GFAP阳性的星形胶质细胞环绕。与远离Aβ聚集区的星形胶质细胞通常呈现单极或双极形态不同，这些环绕Aβ的星形胶质细胞表现出更复杂的多突触形态，且部分突起伸入Aβ聚集内部。这提示Aβ积累可能引起了局部星形胶质细胞的反应性变化。

4. 部分D-Caa相关通路基因在类器官中发生改变：

   • 对已知在D-Caa患者尸脑组织中上调的TGFβ通路进行分析发现，尽管TGFB1和TGFBR2未显示差异，但TGFBR1在D-Caa类器官的D52和D110时间点均显著上调。这与神经前体细胞和前脑神经元基因的上调模式部分吻合。
   • 热休克蛋白HSPA1A在D52的D-CAA类器官中表达上调，提示细胞可能对早期出现的Aβ聚集产生了应激反应。
   • 值得注意的是，与阿尔茨海默病模型不同，D-Caa类器官中未检测到磷酸化Tau蛋白病理的显著增加，这与D-Caa患者脑中缺乏典型Tau病理的临床观察一致。

5. 其他发现：

   • 小胶质细胞标志物AIF1在D52的D-CAA类器官中表达有短暂上调，但未观察到小胶质细胞与Aβ积累的稳定空间关联。
   • 在Aβ积累附近未观察到明显的神经元形态改变，提示该模型中的Aβ聚集可能代表非常早期的、尚未引发明显神经元毒性的病理阶段。

四、 研究结论与意义 本研究成功建立并系统表征了首个D-CAA患者来源的脑类器官模型。该模型能够在体外重现D-CAA的两个核心特征：早期自发的Aβ积累和增强的神经元/前脑分化倾向。同时，模型还揭示了星形胶质细胞的反应性改变以及与疾病相关的TGFBR1通路上调。

科学价值： 1. 提供了新的疾病建模工具：弥补了现有D-CAA细胞和动物模型的不足，为在人类细胞背景下、在三维脑样环境中研究该病的早期细胞和分子机制提供了独特平台。 2. 揭示了潜在的新发病机制：研究发现D-Caa突变可能不仅影响Aβ的聚集特性，还可能通过影响APP功能或其他未知机制，改变神经发育程序。这为理解D-CAA的疾病全貌开辟了新视角。 3. 验证了脑类器官用于血管相关脑病研究的可行性：尽管缺乏血管，该模型仍能捕捉到关键的病理事件，证明了其在研究涉及Aβ代谢和聚集的疾病中的适用性。

应用价值： 1. 药物筛选与治疗开发平台：该模型可用于高通量筛选能够减少Aβ聚集或纠正异常神经分化的小分子药物、基因疗法（如研究中提到的反义寡核苷酸疗法）等，加速治疗策略的临床前评估。 2. 个性化医学研究：未来可扩展用于携带不同突变或来自不同患者的iPSC系，研究疾病的异质性并探索个性化治疗方案。

五、 研究亮点 1. 研究对象的创新性：首次构建并深入研究了荷兰型脑淀粉样血管病这一罕见但具有明确遗传基础的脑血管病的患者来源脑类器官模型。 2. 模型构建的系统性与严谨性：研究涵盖了从患者样本获取、iPSC重编程、等基因对照构建、类器官培养方案优化、到多时间点多维度表型分析（形态、免疫组化、高通量基因表达）的完整流程，质量控制严格，数据相互印证。 3. 重要发现的启发性：不仅证实了预期的Aβ聚集表型，更意外地发现了增强的神经元分化这一发育相关表型，挑战了将D-CAA单纯视为晚期蛋白聚集疾病的传统观念，提示了神经发育异常在疾病发生中的可能作用。 4. 临床病理相关性：模型重现了患者脑中Aβ积累、缺乏Tau病理等关键特征，同时发现的星形胶质细胞反应与TGFBR1上调也与既往尸脑研究结果部分呼应，增强了模型的病理相关性。

六、 其他有价值的补充 本研究也坦诚地讨论了脑类器官模型的局限性，主要是缺乏血管系统，而这正是D-CAA病理发生的核心部位。作者提出，未来可将此类神经类器官与工程化的血管系统或血脑屏障模型相结合，构建更复杂的类器官-血管共培养系统，以更全面地模拟D-CAA的血管中心病理过程。此外，研究中也观察到了类器官个体间的变异性，强调了使用足够数量的生物重复和等基因对照对于得出可靠结论的重要性。