本文由 Chengjie Duan、Wenting Cheng、Yanheng Yao、Dayong Li、Zhongyun Wang 和 Yang Xiang 完成。其中，Zhongyun Wang 来自南京医科大学第一附属医院麻醉科，Yang Xiang 来自南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室和北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室。该研究于2022年9月7日在线发表在美国化学学会（ACS）旗下的期刊《Analytical Chemistry》上，卷期号为 Anal. Chem. 2022, 94, 12919–12926。
这项研究属于分析化学与生物传感交叉领域，具体聚焦于适配体传感器（Aptasensor）的开发与应用。适配体是一类通过体外筛选获得的单链寡核苷酸，能特异性识别并结合靶标分子（如蛋白质、小分子等），其功能类似于抗体，但具有稳定性高、易于化学合成和修饰、可编程性强等优点。因此，基于适配体的生物传感方法在疾病诊断、环境监测和食品安全等领域受到越来越多的关注。然而，现有的适配体传感器普遍面临一个关键挑战：其信号转导机制的通用性（generality）不足。不同的靶标分子（特别是蛋白质）与适配体结合后，往往需要依赖靶标特定的构象变化或竞争置换机制来产生可检测的信号。这种对特定识别机制的依赖限制了传感平台的普适性，使得针对不同靶标需要重新设计和优化传感策略，过程繁琐且缺乏灵活性。
为解决这一通用性问题，研究者们从纳米生物界面的一个普遍现象——“多价生物分子装载”（Polyvalent packing of biomolecules）中获得灵感。当生物分子（如DNA或蛋白质）固定在纳米材料表面时，其最大装载量受到分子大小和形状的显著影响。小而线性的分子（如单链DNA）由于空间位阻小，可以高密度地装载；而非线性的大分子（如蛋白质）由于空间位阻大，在相同表面积上可装载的数量会减少。基于这一原理，如果先用线性小分子（如适配体及其互补链的复合物）将纳米载体表面饱和，当引入靶标蛋白时，形成的蛋白-适配体复合物体积更大，会导致载体表面“超载”（overload），从而挤出一部分原先结合的线性复合物。这种“尺寸依赖性”的信号转导机制不依赖于靶标与适配体结合的具体化学过程，仅与靶标复合物的物理尺寸相关，因此有望成为一种通用的传感设计思路。
本研究的核心目标就是验证并利用这种“超载触发探针逃逸”（overload triggering probe escape）机制，构建一个通用、灵活且灵敏的信号转导模块，并将其应用于特定生物标志物的检测。研究者选择阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的重要生物标志物——Tau蛋白作为模型分析物，以证明该策略的有效性。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，其异常聚集和磷酸化与AD的发病机制密切相关，在脑脊液和血液中的含量是AD诊断的关键指标之一。因此，开发高灵敏、高特异性的Tau蛋白检测方法具有重要的临床意义。
详细工作流程：
本研究的工作流程可以清晰地分为几个关键步骤：传感原理设计与构建、超载现象验证、信号放大集成、条件优化、分析性能评估以及实际样本测试。
第一步：传感原理设计与探针构建。 研究团队设计了一个包含两个功能区域的“适配体互补元件-引物”（aptamer complementary element - primer, ACE-primer）。该分子包含一段紫色标记的“ACE区域”，用于与生物素（biotin）标记的Tau蛋白适配体特异性杂交；以及一段红色标记的“引物区域”，用于触发后续的信号放大反应。整个传感体系以链霉亲和素修饰的磁珠（Streptavidin-modified magnetic beads, SA-MBs）作为固相载体，利用其易于分离和富集探针的特性。在无靶标（Tau蛋白）存在时，ACE-primer与适配体完全杂交，形成的线性双链复合物通过适配体上的生物素被SA-MBs高效捕获并全部从溶液中分离。此时，上清液中不含ACE-primer，无法触发后续信号。当存在靶标Tau蛋白时，Tau蛋白与适配体结合，形成体积庞大且形状不规则的Tau-适配体复合物。这种大复合物同样会通过生物素结合到磁珠上。由于空间位阻效应，大复合物占据的空间远超线性双链，导致磁珠表面的结合位点发生“超载”。其结果是，一部分原本可以结合的适配体/ACE-primer双链（以及可能未杂交的单链ACE-primer）无法结合到磁珠上，从而“逃逸”到上清液中。这样，靶标蛋白的输入就被转换成了上清液中核酸探针（ACE-primer）的输出。这一过程是信号转导的核心。
第二步：超载现象与探针逃逸的实验验证。 研究团队通过多种实验手段严谨地证实了这一机制。首先，他们通过荧光实验确定了SA-MB对适配体/ACE-primer双链的装载容量。使用双链核酸染料SYBR Green I检测磁珠分离后的上清液荧光，发现当双链浓度超过约50 nM时，上清液荧光强度急剧上升，表明磁珠（0.5 mg/mL）的饱和装载量约为50 nM。然后，在固定双链浓度为50 nM（即饱和装载点）的条件下，加入Tau蛋白。结果显示，上清液的荧光强度显著增加，证明有额外的双链复合物因超载而被挤入上清液。这一现象只能用空间位阻导致的超载来解释，而非简单的竞争结合（因为ACE-primer长度优化实验表明，即使使用更长的ACE，信号也未因竞争减弱，反而支持超载机制）。进一步地，通过测量zeta电位的变化，提供了表面化学性质的证据：磁珠在捕获适配体/ACE-primer双链后，表面负电荷增加（从-7 mV变为-16 mV）；而在加入Tau蛋白后，电位正向回移（变为-9 mV），这符合大体积的蛋白质（等电点不同且电荷分布不同）替换部分负电性核酸双链所导致的表面电荷变化。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析提供了更直接的分子证据：在磁珠分离前，可见适配体/ACE-primer双链条带和大分子量的Tau-适配体复合物条带；磁珠分离后，无靶标组的上清液中几乎没有条带，而有靶标组的上清液中则清晰地出现了适配体/ACE-primer双链条带，直观地证明了“探针逃逸”。
第三步：信号放大模块的集成。 为了将微量的探针输出转化为强检测信号，研究引入了催化发夹组装（Catalytic Hairpin Assembly, CHA）循环进行等温放大。从上清液中收集到的ACE-primer（无论是单链还是与适配体杂交的双链，其引物区域均可暴露）可以作为“引物”，触发两个设计好的发夹探针H1和H2发生级联杂交反应。CHA反应具有循环放大特性，一个引物可以催化生成大量H1/H2双链产物。为了便于检测，H1和H2的末端被修饰了生物素。这些大量产生的生物素化H1/H2双链，可以被新加入的SA-MBs捕获，然后再与链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶（SA-HRP）结合。最后，加入显色底物TMB，通过HRP催化产生颜色变化，用肉眼或酶标仪读取吸光度值（450 nm）即可实现定量检测。这种“磁珠分离-CHA放大-比色检测”的级联设计，将超载机制产生的初始信号进行了有效放大。
第四步：实验条件系统优化。 为确保传感器性能最优，研究团队对多个参数进行了系统优化。在信号转导部分：1. ACE长度与结合位点：测试了针对适配体不同区域（茎部与环部）不同长度的ACE序列。发现与适配体环部（loop）结合、长度为18个碱基的ACE-primer（L18）能提供最高的信噪比（信号/背景比）。2. 杂交温度：37°C下杂交比25°C更充分，背景信号更低，这可能是低温下适配体自身折叠或形成二聚体影响了与ACE的结合。3. 探针浓度：确定适配体和ACE-primer的最佳工作浓度均为50 nM，且适配体略过量（浓度比1.5:1）时性能更佳。在信号放大部分：1. CHA反应时间：1小时达到平台期。2. H1和H2浓度：优化后确定H1为15 nM，H2为10 nM。
第五步：分析性能评估。 在最优条件下，对Tau蛋白进行定量检测。比色结果显示，随着Tau浓度从0增加至1000 ng/mL，溶液颜色由无色渐变为深黄色，可实现半定量目视检测。吸光度值与Tau浓度在0.5至10 ng/mL范围内呈良好线性关系，线性方程为A = 0.15504 + 0.04143 tau。根据3倍标准偏差规则，计算出方法的检测限（Limit of Detection, LOD）低至0.254 ng/mL。该灵敏度与已报道的其他检测方法相当，且满足AD早期诊断对Tau蛋白检测的灵敏度要求。选择性实验表明，在高达Tau浓度10倍的干扰物（如牛血清白蛋白BSA、免疫球蛋白IgG、凝血酶、Aβ40和Aβ42）存在下，传感器对Tau的响应信号依然显著，而对干扰物的响应与空白背景相当，显示出良好的特异性。
第六步：实际样本分析验证实用性。 为了评估方法在复杂生物基质中的稳定性和准确性，进行了加标回收实验。在10%人血清和人工脑脊液（CSF）基质中，分别添加不同浓度的Tau蛋白。检测结果显示，在不同基质中，剂量-响应曲线与在纯缓冲液中基本一致，回收率在88.2%至101%之间，相对标准偏差（RSD）在0.321%至1.42%之间，证明了方法的高准确度和稳定性。最具临床意义的一步是，研究团队使用该方法对真实的临床脑脊液样本进行了初步分析。样本来源于两名健康个体和三名AD患者。检测结果显示，AD患者CSF样本产生的吸光度信号显著高于健康个体，统计学分析显示有极显著差异（p < 0.01）。这一结果与AD患者脑脊液中Tau蛋白水平升高的已知临床事实相符，初步证明了该方法具有区分AD患者与健康人的潜力，展现了其临床应用的可行性。
主要结论与研究意义：
本研究成功构建了一种基于“超载触发探针逃逸”新型信号转导机制的通用型适配体传感器，并将其与催化发夹组装放大技术相结合，实现了对Tau蛋白的高灵敏、高选择性检测。该工作的核心科学价值在于提出并验证了一种不依赖于靶标特异性识别化学过程的通用信号转导策略。其创新性在于巧妙利用了纳米界面生物分子装载的尺寸依赖性这一物理原理，将不同靶标蛋白（只要其与适配体结合后形成的复合物尺寸显著增大）的输入，统一转换为同一种核酸探针的输出。这种“模块化”设计理念极具灵活性：信号转导模块（超载机制）可以与不同的信号输出模块（如本研究用的CHA，也可以是其他等温扩增技术或电化学、荧光方法）自由组合，为构建针对各种生物大分子的通用生物传感平台提供了全新思路。
从应用价值来看，该方法不仅成功检测了模型蛋白Tau，其0.254 ng/mL的检测限、良好的选择性和在实际生物样本中的稳健性能，都表明它在疾病生物标志物检测方面具有实际应用前景。特别是在阿尔茨海默病的辅助诊断方面，该方法为Tau蛋白的检测提供了一种无需抗体、操作相对简便、且有望实现便携化或现场检测（Point-of-Care testing, POCT）的新选择。论文最后也指出，未来可通过简化扩增步骤、分析更多临床样本来进一步推动其向临床诊断应用迈进。
研究亮点：
这项工作不仅为Tau蛋白的检测提供了一种高性能的新方法，更重要的是为构建面向广泛生物大分子的通用型生物传感器开辟了一条富有前景的新途径，在分析化学和生物医学诊断领域具有重要的学术价值和潜在的应用影响力。