本文发表于 Frontiers in Microbiology，2021年12月7日，第12卷，文章编号771934。文章类型为综述（review），由 Fuli Ren、Shu Shen、Qiongya Wang、Gang Wei、Chaolin Huang、Hualin Wang、Yun-Jia Ning、Ding-Yu Zhang 和 Fei Deng 等作者共同撰写。通讯作者为 Chaolin Huang、Hualin Wang、Yun-Jia Ning、Ding-Yu Zhang 与 Fei Deng。作者机构主要包括武汉市金银潭医院转化医学研究中心、中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室，以及中国科学院武汉病毒研究所国家病毒资源中心。该综述系统总结了布尼亚病毒目（Bunyavirales）反向遗传学系统的研究进展，重点讨论微型基因组（minigenome, MG）、感染性病毒样颗粒（infectious virus-like particle, iVLP）和全长感染性克隆（infectious full-length clone, iFLC）系统的建立、应用和未来方向。
布尼亚病毒目是RNA病毒中最大的一个类群，包含12个科，其中沙粒病毒科（Arenaviridae）、汉坦病毒科（Hantaviridae）、内罗病毒科（Nairoviridae）、泛布尼亚病毒科（Peribunyaviridae）和白纤病毒科（Phenuiviridae）含有大量可导致人类和动物严重疾病的重要病原体。由于许多高致病性布尼亚病毒需要在生物安全三级（BSL-3）甚至四级（BSL-4）实验室中操作，传统研究受到很大限制。反向遗传学系统可以在较低生物安全等级条件下模拟病毒生命周期的部分或全部过程，因此成为研究病毒复制、转录、致病机制以及开发疫苗和抗病毒药物的重要工具。
病毒基因组结构：大多数布尼亚病毒具有分节段的单链负义或双义RNA基因组。沙粒病毒科病毒基因组通常由两个节段（L和S）组成，而汉坦病毒科、内罗病毒科、泛布尼亚病毒科和白纤病毒科病毒基因组一般由三个节段（L、M和S）组成。L节段编码RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp），M节段主要编码糖蛋白前体，S节段编码核蛋白（nucleoprotein, N）以及非结构蛋白NSs。部分病毒如布尼亚韦拉病毒（Bunyamwera virus, BUNV）和裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）的M节段还编码非结构蛋白NSm。
反向遗传学系统的类型：MG系统利用报告基因（如增强型绿色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶或荧光素酶）替代病毒蛋白编码区，保留病毒基因组末端非翻译区（untranslated regions, UTRs）等顺式作用元件，用于模拟病毒基因组转录和复制。RdRp和N蛋白通过辅助质粒或辅助病毒反式提供。iVLP系统在MG系统基础上额外提供糖蛋白Gn/Gc，使形成的核糖核蛋白复合体（ribonucleoprotein, RNP）能够被包装成具有单轮感染能力的病毒样颗粒，从而模拟病毒入侵、组装和出芽过程。iFLC系统则通过共转染表达全长病毒基因组节段以及RdRp和N蛋白的质粒，直接拯救出具有完整复制能力的重组病毒。
代表性病毒的反向遗传学系统：综述表1总结了多种布尼亚病毒已建立的系统。例如，拉沙病毒（Lassa virus, LASV）建立了T7和RNA聚合酶I（polymerase I, pol-I）驱动的MG和iFLC系统；淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）建立了T7驱动的MG和iFLC系统；BUNV建立了T7和pol-I驱动的MG、iVLP和iFLC系统；RVFV建立了T7和pol-I驱动的MG、iVLP和iFLC系统；克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV）建立了T7驱动的MG、iVLP和iFLC系统。此外，发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV）和哈特兰病毒（Heartland virus, HRTV）也建立了MG和iVLP系统。
MG系统的应用：MG系统主要用于鉴定病毒复制和转录所需的顺式和反式作用元件、绘制病毒启动子关键残基、研究病毒包装机制以及筛选抗病毒化合物。例如，Dunn等人在1995年建立了BUNV的T7驱动MG系统，并利用该系统对N蛋白进行大规模突变分析。Flick等人在2003年建立了汉坦病毒（Hantaan virus, HTNV）的pol-I驱动MG系统，为研究汉坦病毒关键基因功能提供了工具。CCHFV的MG系统揭示了L蛋白的卵巢肿瘤蛋白酶活性对病毒RNA复制并非必需。
iVLP系统的应用：iVLP系统能够模拟单轮感染过程，因此被广泛用于研究病毒入侵、组装、出芽和包装。Shi等人在2006年首次构建了BUNV的iVLP系统，用于研究NSm蛋白在病毒组装和形态发生中的作用。RVFV的iVLP系统揭示了干扰素诱导蛋白MxA对病毒初级和次级转录的抑制作用。CCHFV的转录和进入竞争性病毒样颗粒（transcription and entry-competent virus-like particle, tc-VLP）系统被用于定位L蛋白的内切酶结构域，并评估其作为疫苗候选的免疫原性和保护效果。
组合式MG和iVLP系统：为了评估亲缘关系较近的布尼亚病毒之间的基因组重配潜力，研究者还建立了组合式MG和iVLP系统。例如，Ren等和Rezelj等分别开发了基于SFTSV、HRTV、古尔图病毒（Guertu virus, GTV）等班达病毒属（Bandavirus）病毒的组合式系统，发现SFTSV和HRTV的RdRp和N蛋白在鼠pol-I驱动系统中不能交叉识别，但SFTSV和GTV的N蛋白可以相互替代形成功能性RNP。这些系统为研究病毒基因组重配潜力和进化过程提供了重要工具。
iFLC系统的应用：iFLC系统能够拯救重组病毒，因而被广泛用于研究病毒复制周期、构建减毒活疫苗候选株以及进行高通量药物筛选。Bridgen和Elliott在1996年首次从cDNA克隆中拯救出BUNV。之后，Lowen等人利用稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞系提高了BUNV的拯救效率。基于iFLC系统，研究者构建了多种重组病毒。例如，LCMV减毒活疫苗候选株通过将S节段基因间区插入L和S节段而构建；LASV的减毒活疫苗候选株则通过密码子去优化糖蛋白基因获得。RVFV的经典减毒活疫苗候选株包括基因组节段重排病毒和单周期复制病毒，均基于iFLC系统构建。
现有系统的局限性：尽管反向遗传学系统为布尼亚病毒研究提供了重要平台，但其结果解释需谨慎。由于质粒转染系统表达的是裸露RNA，随后才被N蛋白包裹，这与自然感染过程存在差异。例如，BUNV和RVFV的NSs蛋白在MG系统中对病毒聚合酶活性的影响在不同实验中得出了矛盾结果。这些差异可能与质粒转染系统和真实病毒感染之间的机制差异有关。此外，如果重组病毒因引入突变而无法被拯救，仅用iFLC系统难以确定病毒复制周期中具体哪一步受阻，需要结合MG或iVLP系统进行解析。
未来展望：目前尚不清楚病毒N蛋白如何选择性识别MG RNA中的外源部分，以及RdRp和N蛋白如何识别异源MG RNA形成功能性RNP复合体。布尼亚病毒后代病毒粒子包装基因组节段是选择性包装还是随机包装也仍待阐明。基于对布尼亚病毒共同特征的深入理解，未来有可能快速构建针对亲缘关系较近的新发布尼亚病毒的二价或多价疫苗，为应对突发疫情提供有效保护。
总结：反向遗传学技术的发展极大促进了人们对负义RNA病毒，尤其是布尼亚病毒目病毒生命周期的理解。该综述系统梳理了MG、iVLP和iFLC系统的构建策略和应用进展，强调了这些系统在研究病毒复制周期、病毒-宿主互作、致病机制和进化过程中的重要作用。同时，文章也指出当前系统的局限性和未解决的问题，为未来布尼亚病毒反向遗传学研究提供了方向性参考。