本研究由Oju Jeon、Sun-Woong Kang、Hee-Won Lim、Ji Hyung Chung和Byung-Soo Kim等人完成，主要作者隶属于汉阳大学化学工程系与生物工程系，以及延世大学衰老科学研究所和心血管研究所。论文发表于*Biomaterials*期刊2006年第27卷第1598–1607页，于2005年6月9日收稿，2005年8月23日接受，2005年9月16日在线发表。
本研究属于生物材料与药物控制释放领域，主要针对碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在体内的短半衰期和快速降解问题，开发能够长期、零级释放bFGF的递送系统。bFGF具有促进血管新生和组织再生的治疗潜力，但由于其在体内易降解，传统注射方式难以维持有效浓度。已有多种bFGF递送系统如藻酸盐珠、胶原海绵、透明质酸凝胶和纤维蛋白凝胶等，但多数释放时间短于3天，或虽然释放时间较长但难以控制释放速率。本研究旨在利用肝素缀合聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(l-lactide-co-glycolide)，PLGA）纳米球（heparin-conjugated PLGA nanospheres，HCPNs）悬浮于纤维蛋白凝胶中，实现bFGF的长期、零级、可控释放，并评估该系统在体外和体内促进血管新生的效果。
研究首先合成了四种不同类型的PLGA，包括线性PLGA和星形PLGA，分别使用1,6-己二醇或二季戊四醇为引发剂，并通过开环聚合制备。利用核磁共振氢谱（¹H-NMR）确认了星形PLGA的结构和端基比例。随后通过碳二亚胺化学方法将PLGA末端羟基转化为氨基，得到氨基末端PLGA（aminated-PLGA）。采用油/水乳化-溶剂蒸发法将氨基末端PLGA制备成纳米球，再利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将肝素共价结合到纳米球表面，制得HCPNs。通过甲苯胺蓝法测定肝素缀合量，结果显示肝素缀合量受PLGA分子量和结构类型显著影响。低分子量PLGA纳米球的肝素缀合量高于高分子量PLGA纳米球，星形PLGA纳米球的肝素缀合量显著高于线性PLGA纳米球，最高可达29倍差异。扫描电镜显示HCPNs为球形、分散且表面光滑，粒径小于250 nm。
在体外释放实验中，研究比较了三种递送形式的bFGF释放曲线：游离肝素纤维蛋白凝胶、HCPNs单独悬浮液、以及HCPNs悬浮于纤维蛋白凝胶。结果显示纤维蛋白凝胶中的bFGF在约8天内几乎全部释放，呈快速释放特征；HCPNs单独悬浮可实现bFGF持续释放3周且无明显突释；而HCPNs悬浮于纤维蛋白凝胶可将释放时间延长至4周以上，且释放曲线接近零级释放。进一步研究发现，通过改变纤维蛋白凝胶中纤维蛋白原浓度可以调控bFGF释放速率。当纤维蛋白原浓度为9.4 mg/ml时，28天内约释放85%的装载bFGF；当浓度提高至188.6 mg/ml时，28天仅释放约49%，仍有51%的bFGF保留在凝胶中。凝血酶浓度对释放速率无显著影响。
在生物活性评价中，使用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）培养体系评估释放的bFGF活性。结果表明，在含有bFGF-HCPNs-纤维蛋白凝胶递送系统的培养基中，HUVEC在15天内保持持续生长，其生长曲线与每日添加游离bFGF的阳性对照组相当。而单独使用bFGF-纤维蛋白凝胶的培养基在7天后的细胞数量下降，这与纤维蛋白凝胶中bFGF约8天释放完全的结果一致。这说明HCPNs-纤维蛋白凝胶递送系统可以长期释放具有生物活性的bFGF。
在小鼠后肢缺血模型中评估bFGF递送系统的治疗效果。将装载bFGF的HCPNs悬浮于纤维蛋白凝胶中注射到小鼠缺血后肢，将每日皮下注射bFGF和注射bFGF-纤维蛋白凝胶作为对照组。4周后通过免疫组织化学染色分析毛细血管密度和增殖毛细血管密度。结果显示，bFGF-HCPNs-纤维蛋白凝胶组的微血管密度显著高于每日注射bFGF组和bFGF-纤维蛋白凝胶组。定量统计显示，无处理对照组毛细血管密度为292±89个/mm²，bFGF每日注射组为579±63个/mm²，bFGF-纤维蛋白凝胶组为681±24个/mm²，而bFGF-HCPNs-纤维蛋白凝胶组为870±105个/mm²。5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）阳性毛细血管密度也呈现类似趋势，HCPNs-纤维蛋白凝胶组显著高于其他各组。
研究结论认为，HCPNs悬浮于纤维蛋白凝胶的递送系统能够实现bFGF超过1个月的近零级释放，释放速率可通过纤维蛋白原浓度调控；释放的bFGF保持生物活性，并能在小鼠后肢缺血模型中显著增强血管新生效果。该系统结合了PLGA纳米球和纤维蛋白凝胶的优点，既能避免PLGA纳米球在体内的迁移问题，又能利用纤维蛋白凝胶的临床可注射性和生物相容性。长期、可控的bFGF递送为心肌缺血、肢体缺血、创伤愈合和骨再生等治疗提供了新的策略。该系统还可扩展到递送其他与肝素具有亲和力的生长因子，如血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、表皮生长因子和骨形态发生蛋白等，有望实现多因子协同递送以增强血管新生效果。
本研究的亮点包括：首次将肝素缀合PLGA纳米球与纤维蛋白凝胶复合用于bFGF递送；通过调节PLGA分子量和结构显著提高肝素缀合量；实现了近零级释放超过1个月；证明了该递送系统在体内外均具有增强血管新生的能力。该研究为生长因子控制释放领域提供了新的材料设计思路和实验依据。