这篇文档发表于 journal of the kimst, Vol. 24, No. 3, pp. 348-355, 2021，是一篇题为“한탄바이러스 76-118을 이용한 치사 동물모델 확립”（Establishment of a lethal animal model of Hantaan virus 76-118 infection）的原创性研究论文。第一作者及通讯作者是 송영조 (Young Jo Song)，作者团队来自 국방과학연구소（韩国国防科学研究所），包括 제4기술연구본부（第四技术研究本部）和 국방첨단기술연구원（国防尖端技术研究院）。

该研究属于病毒学和实验动物模型领域，旨在解决汉坦病毒（Hantaan virus, HTNV）研究中的一个关键瓶颈。汉坦病毒是肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）的主要病原体，对人类构成严重威胁，且具有潜在的生物武器风险。然而，其疫苗和抗病毒药物研发面临重大障碍：一方面，已获韩国食品医药品安全处（MFDS）有条件批准的疫苗Hantavax®效果有限；另一方面，缺乏能够模拟人类致死性疾病的、有效的成年或亚成年小鼠致死模型。现有模型多依赖于新生或乳鼠，其导致的疾病（致死性神经系统疾病或持续感染）与人类HFRS的病理特征不符，限制了候选药物和疫苗的有效性评估。因此，本研究的目标是建立一个高效、可靠的HTNV致死性动物模型，特别是针对非新生鼠类，以推进相关治疗和预防策略的临床前研究。

研究的详细工作流程系统且全面，主要包含以下几个核心环节： 第一，模型动物与病毒准备。 研究使用的病毒是HTNV 76-118株，在Vero E6细胞中培养并测定了病毒滴度。为了获得高滴度的病毒用于动物攻击，研究团队还将病毒原液颅内接种于ICR乳鼠，取发病鼠脑组织制备匀浆液，最终获得了高滴度的病毒储存液（5×10^6 PFU/mL）。所有涉及活病毒的实验均在生物安全三级（BL-3）设施中进行，确保了实验安全。实验动物包括叙利亚金黄仓鼠（Syrian golden hamster）以及ICR、BALB/c、C57BL/6三种品系的小鼠，动物实验获得了研究所动物实验伦理委员会的批准。 第二，多物种、多品系、多条件的预筛选试验。 研究并未直接聚焦于单一模型，而是进行了广泛的探索性测试，以确定建立致死模型的最佳条件。这一阶段包括多个独立实验：1) 仓鼠试验：分别对5周龄雄鼠、24日龄雄鼠和5周龄雌鼠，通过腹腔注射（intraperitoneal, IP）途径接种不同剂量的HTNV，剂量范围从10^1到10^5 PFU/只。2) BALB/c小鼠试验：对5周龄雌鼠IP接种HTNV（10^2至5×10^4 PFU/只）；此外，使用HTNV感染的乳鼠脑匀浆液（滴度~4×10^5 PFU）对3周龄BALB/c小鼠进行IP攻击。3) C57BL/6小鼠试验：对9周龄雌鼠IP接种HTNV（10^4和2×10^4 PFU/只）。这些试验均未观察到显著的临床症状或死亡。 第三，聚焦ICR小鼠的深入测试。 在以上预试验未获成功的基础上，研究重点转向了ICR小鼠，并系统测试了日龄、接种途径和剂量的影响。这构成了研究的关键部分：1) 15日龄ICR小鼠颅内接种（intracranial, IC）：设置了四个剂量组（10, 50, 100, 500 PFU/只），每组8只。2) 3周龄ICR小鼠IC接种：设置了从0到2000 PFU/只的六个剂量组，每组5只。3) 3周龄ICR小鼠IP接种：作为对照，设置了与上述IC接种相同的剂量组，以比较接种途径的影响。4) 20日龄ICR小鼠鼻内接种（intranasal, IN）：设置了四个剂量组（12到1.2×10^4 PFU/只），每组10只。这些实验详细记录了体重变化、临床体征（如活动减少、抽搐）和存活率。 第四，致死剂量50%（LD50）的精确测定。 在确定了IC接种对特定日龄ICR小鼠有效后，研究进入了定量分析阶段。使用20日龄ICR小鼠，设置了从0到50 PFU/只的六个剂量组（通过2倍系列稀释），每组10只（对照组3只），均采用IC途径接种。随后在两周内观察记录死亡情况，并采用概率单位分析法（probit analysis）计算LD50值。

研究取得了一系列明确且重要的结果： 在预筛选试验中，所有仓鼠（无论日龄和性别）、BALB/c小鼠（包括使用脑匀浆液攻击的组）以及C57BL/6小鼠，在IP接种HTNV后均未发生死亡。这一结果与部分早期报道相矛盾，但支持了Klingström等人（2006）的研究发现，即成年或亚成年小鼠对HTNV的IP攻击不易感，提示建立致死模型需要更苛刻的条件。 在ICR小鼠的测试中，结果清晰地揭示了关键影响因素：1) 接种途径至关重要：15日龄和3周龄ICR小鼠在IC接种HTNV后，均出现了剂量依赖性的体重下降（见图1、3）、活动减少、抽搐等症状，并最终死亡。然而，对3周龄ICR小鼠进行IP接种，即使剂量高达2000 PFU/只，也未引发任何临床症状或死亡。同样，对20日龄ICR小鼠进行IN接种也未导致死亡。这表明，直接的中枢神经系统感染是引发ICR小鼠急性致死性疾病的关键。2) 动物日龄显著影响易感性：对比15日龄和3周龄ICR小鼠的IC接种结果发现，日龄越大，对病毒的抵抗力似乎越强。在相近的剂量下（如50-100 PFU/只），15日龄小鼠的死亡率（87.5%-100%）普遍高于3周龄小鼠（20%-60%）。这证实了随着年龄增长，小鼠对HTNV的易感性降低的规律。3) 成功建立致死模型并计算LD50：最终，在标准化的20日龄ICR小鼠IC接种模型中，研究取得了成功。小鼠在接种后第8-9天开始死亡（见图6），死亡率呈现清晰的剂量依赖性（见表14）。通过概率单位分析，计算出HTNV 76-118株对20日龄ICR小鼠的半数致死量（LD50）为2.365 PFU/只。这一数值极低，表明通过IC途径，极小剂量的病毒即可在此模型中引发致死性感染，模型灵敏度高。

基于以上结果，本研究得出了明确的结论：成功建立了一个使用20日龄ICR小鼠、通过颅内接种途径的HTNV致死性动物模型，并首次精确测定了该模型下的LD50值（2.365 PFU/只）。该模型填补了HTNV研究工具的重要空白。其科学价值在于，提供了一个在非新生鼠（20日龄）身上可重复、可量化（有明确LD50）的致死性感染系统，这比使用新生乳鼠（其免疫系统不成熟，疾病表现可能与人类不同）的模型更接近于评估药物或疫苗在具有一定免疫功能的宿主中的效果。应用价值则直接指向药物和疫苗研发：该模型可用于高效、标准化地评估候选抗病毒药物或新型疫苗对HTNV感染的保护效力，为后续的临床前药效学研究提供了关键的平台。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面： 1. 系统性与严谨性：研究没有局限于单一品系或条件，而是通过系统性地测试不同动物物种（仓鼠、不同品系小鼠）、日龄（从乳鼠到成年鼠）、接种途径（IP、IC、IN）和病毒制备（细胞培养病毒 vs. 动物组织来源病毒），最终筛选并优化出了最有效的模型构建条件。这种全面的方法确保了结论的可靠性。 2. 模型的创新性与实用性：成功建立的20日龄ICR小鼠IC模型是一个重要的方法学创新。它避开了新生鼠模型的局限性，提供了一个年龄相对统一、操作更标准化、且能明确计算LD50的模型。文中明确指出，这是首次在非乳鼠阶段报告HTNV的LD50值。 3. 对既往研究的验证与澄清：研究结果验证了Klingström等人关于成年BALB/c和C57BL/6小鼠对HTNV腹腔感染不易感的发现，同时通过成功的IC接种模型，解释了为何某些早期研究（如Wichmann等，2002）可能得出了不同的结论，可能源于接种途径或动物状态的细微差异。 4. 明确的关键影响因素：研究清晰地揭示了接种途径（IC vs. IP/IN） 和动物日龄是决定HTNV在小鼠模型中能否引起致死性感染的两个最关键因素，这对于理解该病毒的致病机制和未来模型设计具有指导意义。

此外，研究还包含一些有价值的细节。例如，研究团队尝试使用了动物传代（乳鼠脑）病毒，以探究其与细胞培养病毒在致病性上是否存在差异，虽然在BALB/c小鼠中未观察到差异，但这种尝试体现了对病毒生物学特性的深入探索。同时，所有实验均在高级别生物安全实验室（ABL-3/BL-3）内完成，符合高危病原体研究的规范，保证了生物安全。最终，该模型作为韩国国防科学研究所内部研究项目（课题号：912664201）的成果，其建立直接服务于抗病毒治疗剂的开发与评价，具有明确的国家防御与公共卫生应用前景。