该文档为类型a，即单项原始研究论文。以下为该研究的学术报告。
本研究由Xiuhong Ye、Sihui Chen、Wei Xiong、Fan Wang、Hon Fai Chan、Haocheng Lai等多位学者共同完成，主要通讯作者为Guei-Sheung Liu、Yonglong Guo和Jiansu Chen。研究机构包括暨南大学第一附属医院眼科、暨南大学医学院眼科研究所、香港中文大学组织工程与再生医学研究所、华南农业大学兽医学院等。该研究于2025年发表于 Advanced Science，论文DOI为10.1002/advs.202417363，标题为《Magnetic-Guided Delivery of Antisense Oligonucleotides for Targeted Transduction in Multiple Retinal Explant and Organoid Models》（磁引导递送反义寡核苷酸在多种视网膜外植体与类器官模型中的靶向转导）。
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）疗法在遗传性视网膜疾病、青光眼及干眼症等眼部疾病中具有广阔前景，但其递送效率低下及缺乏有效评估模型一直是限制其临床转化的关键瓶颈。视网膜的多层细胞结构以及内界膜（inner limiting membrane, ILM）、外界膜（outer limiting membrane, OLM）等生理屏障严重阻碍ASO到达靶细胞。近年来，磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles, MNPs）在药物递送领域显示出独特优势，已有研究将其用于视网膜外植体模型中的RNA干扰和腺相关病毒（AAV）递送。因此，本研究旨在利用MNPs增强ASO的递送效率，并在小鼠、猕猴视网膜外植体以及人源视网膜和耳类器官中系统评估其分布、靶向性和治疗效果，建立一种可推广的ASO递送与疗效评估平台。
研究的工作流程可分为多个递进环节。首先，研究在小鼠神经视网膜悬浮培养模型中优化ASO递送条件。使用2‘-O-甲氧基乙基（MOE）修饰且全硫代磷酸化、末端标记Cy3荧光的ASO（ASO-Cy3），将神经视网膜悬浮于培养基中，并比较五种商品化转染试剂（Advanced DNA RNA Transfection Reagent, ATR；RNA TransMate, RTM；Lipofectamine RNAiMAX, LRM；Sitian 2.0, SIT；Interferin, INT）的转染效率。结果显示ATR转染效率最高，被用于后续实验。随后分别以10、50、100、200 nM四种浓度的ASO-Cy3转染外植体，并在第2、7、14、28天进行荧光追踪。研究发现荧光强度在光感受器层（photoreceptor layer, PL）呈现浓度依赖性上升，于第7至14天达到峰值；而神经节细胞层（ganglion cell layer, GCL）的荧光强度则持续上升至第28天。为优化靶向递送，研究者将视网膜外植体展平并固定于环形套圈（collar）中，构建了两种定向模型：GCL朝上以靶向视网膜神经节细胞，以及外核层（outer nuclear layer, ONL）朝上以靶向光感受器。将MNP@ATR-ASO-Cy3复合物加入上层腔室，并在下方放置磁板，利用磁力牵引复合物穿透视网膜。结果显示，GCL朝上组中约60%的ASO积聚于GCL，28%位于内核层（inner nuclear layer, INL），12%位于ONL；ONL朝上组中约72%的ASO定位于光感受器内节/外节（IS/OS），21%位于INL，7%位于GCL。在悬浮培养的弯曲外植体中，MNP同样显著增强了ASO在GCL和IS/OS中的富集。
其次，研究在猕猴视网膜外植体中验证了该体系的适用性与安全性。为遵循3R原则，每只猕猴的神经视网膜被分割为12至15个片段。在无MNP条件下，ASO-Cy3于转染后48小时主要积聚于ONL和PL，第7天逐渐向INL和GCL迁移。在有MNP且GCL朝上的条件下，ASO-Cy3可有效穿过ILM并主要积聚于GCL和INL；在ONL朝上时，ASO-Cy3则被限制于光感受器层，难以穿过OLM进入ONL。经MNP递送后，Müller细胞形态出现一定程度的结构紊乱和缩短，但GFAP和Iba1染色未显示小胶质细胞或胶质细胞显著活化，提示该方法在灵长类组织中具有一定的安全性。
第三，为模拟体内玻璃体注射的真实环境，研究构建了神经视网膜-视网膜色素上皮/脉络膜-巩膜复合体的体外仿生模型。将小鼠眼球去除角膜、晶状体和玻璃体后，将MNP@ATR-ASO-Cy3复合物注入空玻璃体腔，下方放置磁板。结果显示，无MNP时ASO-Cy3主要积聚于巩膜区域；而有MNP时，ASO可有效进入GCL并部分渗透至INL。为进一步维持视网膜生理球形结构，研究者向玻璃体腔填充I型胶原，并在灌注系统中进行动态培养。第2天和第7天的免疫荧光显示视网膜平坦度和神经视网膜与RPE的贴附显著改善。定量PCR结果显示，与静态培养相比，动态培养第7天时促凋亡基因Bax表达显著降低，抗凋亡基因Bcl-2表达升高，应激标志物Hsp70显著下降，GFAP表达无统计学差异。这表明动态灌注培养可显著减轻视网膜细胞凋亡和应激反应。
第四，研究评估了MNP增强ASO介导的剪接调控治疗效果。利用Ush2a基因c.8532-2A>G点突变小鼠模型，该突变与人类USH2A c.8559-2A>G突变同源。研究者使用处于临床试验阶段的寡核苷酸QR-421a（在小鼠模型中称为mQR-421a），该药通过调节剪接促进USH2A基因外显子13跳跃。在视网膜外植体中，裸ASO组外显子12跳跃率为3%，无MNP组为6%，有MNP组为7%；经环己酰亚胺（cycloheximide）抑制RNA降解后，跳跃率分别提高至约20%。在视网膜-RPE/脉络膜-巩膜复合体模型中，有MNP组的外显子12跳跃率显著提高，达到约27%。这些结果表明MNP可增强ASO在克服ILM屏障及靶向特定细胞层中的作用，从而提升ASO介导的剪接调控疗效。
第五，研究在人类诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的视网膜类器官（human retinal organoids, HROs）和内耳类器官（human inner ear organoids, HIEOs）中系统优化并验证了MNP辅助ASO递送。首先在HROs中比较五种转染试剂，ATR转染效率最高且细胞毒性较低。以200 nM ASO-Cy3转染HROs后，第7天Cy3阳性细胞比例从第2天的12%上升至32%。在80天分化的HROs中，MNP辅助转染将Cy3阳性细胞比例从无MNP第7天的38%提升至有MNP第2天的63%，且荧光强度显著增强。共聚焦Z轴层扫显示，有MNP时ASO在类器官表面和中心均呈密集且均匀分布，而无MNP时ASO难以穿透致密神经层。在HIEOs中，MNP同样显著提高了转染效率，Cy3阳性细胞比例从无MNP组的约40%提升至有MNP组的约70%。此外，研究首次比较了HROs和HIEOs在不同分化阶段USH2A转录本的表达差异，发现HIEOs在较早阶段（第30天）即可显著表达USH2A外显子13，而HROs需80天才达到相似水平，为Usher综合征的多器官模型研究提供了新思路。
本研究的核心价值在于首次建立了MNP-外植体-类器官平台，用于促进ASO转染效率、治疗筛选和靶向递送。研究通过小鼠和猕猴视网膜外植体验证了MNP在克服ILM和OLM等生理屏障中的有效性，并在人源视网膜和耳类器官中实现了ASO递送效率的显著提升。该平台不仅为ASO治疗遗传性视网膜疾病提供了更可靠的临床前评估模型，也为其他核酸药物的递送研究提供了新工具。在应用层面，该研究为QR-421a等剪接调控型ASO的临床应用奠定了基础，同时提出的动态培养仿生视网膜模型可更真实地模拟体内药物代谢环境。此外，该研究在灵长类组织中验证了MNP递送的安全性，为后续体内实验和临床转化提供了关键数据支持。
研究的创新点与亮点包括：其一，首次将MNP辅助递送策略系统应用于小鼠和猕猴视网膜外植体以及人源视网膜和耳类器官中，建立了跨物种、跨组织类型的ASO递送评估体系；其二，构建了可动态灌注培养的神经视网膜-RPE/脉络膜-巩膜复合体模型，首次在体外模拟玻璃体注射途径下的ASO递送与代谢；其三，首次比较了等基因人视网膜和耳类器官中USH2A转录本的时序表达差异，发现内耳类器官可更快地提供可编辑RNA靶标；其四，通过多次定量分析证实MNP可显著增强ASO穿透ILM和OLM的能力，且未引起神经胶质显著活化，具有良好的组织相容性。总体而言，该研究为基因治疗领域提供了一种新颖、安全且高效的ASO递送方案，并为遗传性视网膜和耳部疾病的联合治疗研究开辟了新方向。