关于非经典Wnt信号通路在人类主动脉瓣钙化中作用的学术研究报告
一、 研究作者、机构及发表信息
本研究的主要作者包括 Isabella Albanese, Bin Yu, Hamood Al-Kindi, Bianca Barratt, Leah Ott, Mohammad Al-Refai, Benoit de Varennes, Dominique Shum-Tim, Marta Cerruti, Ophélie Gourgas, Eric Rhéaume, Jean-Claude Tardif, Adel Schwertani。研究团队主要来自加拿大麦吉尔大学健康中心（McGill University Health Centre）的心脏病学部和心脏外科部，以及麦吉尔大学材料工程系和蒙特利尔大学蒙特利尔心脏研究所。
该研究于2017年3月发表在《动脉硬化、血栓形成和血管生物学》（*Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology*）期刊上，具体卷期为第37卷第3期，页码543-552，在线发表日期为2016年11月28日。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于心血管疾病基础与转化研究领域，聚焦于心脏瓣膜病的发病机制。主动脉瓣钙化是主动脉瓣狭窄的主要原因，后者是一种进行性疾病，可导致心力衰竭、心绞痛、晕厥和死亡。传统观点认为主动脉瓣钙化是与高龄相关的钙被动沉积过程，但近年研究证实，这是一个涉及瓣膜细胞、循环细胞、骨髓来源细胞以及生物化学和机械因素的主动过程。
Wnt信号通路在心脏瓣膜发育中具有重要功能，调控内皮-间质转化和细胞增殖。已有强有力证据表明经典（β-连环蛋白依赖）Wnt信号级联反应参与了瓣膜钙化。例如，Caira等人发现LRP5/Wnt3信号标志物在人类钙化主动脉瓣中高表达。然而，尽管有证据表明Wnt信号在成骨分化和发育中发挥作用，但关于非经典Wnt配体（如Wnt5a、Wnt5b和Wnt11）在瓣膜钙化中的作用却知之甚少。鉴于越来越多的证据表明瓣膜钙化重现了骨骼发育过程，以及非经典Wnt配体在成骨作用中的关键角色，它们成为研究主动脉瓣钙化的重要靶点。
因此，本研究旨在验证以下假设：非经典Wnt配体Wnt5a、Wnt5b和Wnt11在狭窄的主动脉瓣中表达上调，并可能参与该疾病的发病机制。研究目标包括：1）在非钙化和钙化主动脉瓣组织中检测这些Wnt配体的分布；2）在人类主动脉瓣间质细胞（HAVICs）中评估它们对细胞凋亡和钙化的影响；3）探索其潜在的下游信号通路。
三、 详细研究流程
本研究采用了多种实验技术，流程严谨，从组织水平到细胞和分子水平逐步深入。
第一部分：非经典Wnt配体在人类主动脉瓣组织中的表达分析 1. 研究对象与样本：研究使用了人类主动脉瓣组织样本，包括非钙化（正常）瓣膜和钙化（狭窄）瓣膜。样本来源未明确说明具体数量，但从图表和上下文推断，涉及了多例患者样本，并区分了二叶式主动脉瓣（BAV）和三叶式主动脉瓣（TAV）钙化样本。 2. 实验方法与流程： * 免疫组织化学（IHC）：对瓣膜组织切片进行染色，以定位Wnt5a、Wnt5b和Wnt11蛋白在瓣膜不同区域（如钙化灶、炎症细胞、纤维化区域、肌成纤维细胞、微血管等）的表达和分布。同时进行了共定位染色，以观察这些Wnt蛋白与特定标志物（如CD68、α-平滑肌肌动蛋白、骨桥蛋白、β-连环蛋白、骨形态发生蛋白2等）的共存情况。对染色结果进行了半定量分析，并计算了Wnt表达强度与钙化、纤维化、脂质、炎症、新生血管等病理特征之间的Spearman等级相关性。 * 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）：从瓣膜组织中提取RNA，检测Wnt5a、Wnt5b和Wnt11的mRNA表达水平，比较钙化瓣膜与正常瓣膜，以及钙化BAV与钙化TAV之间的差异。 * 蛋白质印迹法（Western Blotting）：检测瓣膜组织以及从瓣膜中分离培养的HAVICs中Wnt5b和Wnt11的蛋白表达水平，并与正常皮肤成纤维细胞进行比较。 * 临床-病理关联分析：将免疫组化评分与临床参数（如主动脉瓣面积、主动脉射流速度、跨瓣最大/平均压差、Parsonnet评分、HbA1c等）进行相关性分析，以探索Wnt表达与疾病严重程度的关系。
第二部分：非经典Wnt配体对HAVICs功能影响的体外研究 1. 研究对象：从非钙化和钙化的人主动脉瓣中分离并培养原代人类主动脉瓣间质细胞（HAVICs）。 2. 实验方法与流程： * 细胞增殖与凋亡检测：将来自非钙化瓣膜的HAVICs分别置于普通培养基（DMEM）和成骨培养基（OSM）中，用重组人源Wnt5a、Wnt5b、Wnt11蛋白（rhWnts）处理。通过流式细胞术（Annexin V/efluor 780染色）和Caspase-3/7活性检测，分析处理4小时、24小时及更长时间后对细胞凋亡的影响。通过细胞计数或相关试剂盒评估细胞增殖情况。 * 碱性磷酸酶（ALP）活性检测：评估rhWnts处理对HAVICs中ALP活性的影响。 * 细胞钙化诱导与评估： * 茜素红S染色：将HAVICs在OSM中培养3周，期间加入rhWnts。通过茜素红S染色定性观察钙结节形成，并通过定量提取染色染料来相对定量钙沉积量。 * 拉曼光谱分析：这是一种关键且相对新颖的技术应用。研究使用拉曼光谱对经rhWnts处理的HAVICs细胞裂解物以及人类钙化瓣膜组织中的沉积物进行成分分析。通过检测960 cm⁻¹处的特征峰（磷酸基团的ν1振动）来确认羟基磷灰石（骨骼主要无机成分）的存在。通过计算该峰面积与1440 cm⁻¹处（CH₂/CH₃基团拉伸）峰面积的比值，定量评估无机物（羟基磷灰石）相对于有机物的沉积量。此外，通过测量ν1磷酸峰的半高宽来评估羟基磷灰石沉积物的结晶度，并与合成的羟基磷灰石、天然骨骼和牙釉质进行比较。 * 成骨相关基因表达分析：使用RT-qPCR检测经rhWnts处理后，HAVICs中多种成骨介质和细胞标志物（如骨桥蛋白、骨钙素、RUNX2、BMP2、胶原蛋白等）的mRNA表达变化。 * 信号通路研究： * 磷酸化蛋白检测：使用Western Blotting检测经rhWnts处理的HAVICs中关键信号分子（如JNK1/2/3、AKT1、p38 MAPK）的磷酸化水平变化。 * 通路抑制剂实验：在OSM中培养HAVICs时，加入特定信号通路抑制剂（如p38 MAPK抑制剂SB203580、GSK3β抑制剂CHIR99021、ERK1/2抑制剂PD184352、mTOR抑制剂SP600125、JNK抑制剂雷帕霉素），单独或与rhWnts联合使用，观察它们对茜素红S染色所测钙沉积的影响，以探究介导Wnt促钙化效应的下游通路。
第四部分：主要研究结果
1. 非经典Wnt配体在钙化主动脉瓣中表达上调并定位于病理区域。 * mRNA水平：RT-qPCR结果显示，与正常瓣膜相比，Wnt5a、Wnt5b和Wnt11的mRNA在钙化主动脉瓣中表达显著升高。特别值得注意的是，Wnt5b的mRNA在钙化的二叶式主动脉瓣（BAV）中表达显著高于钙化的三叶式主动脉瓣（TAV）。 * 蛋白水平与定位： * Wnt5b：Western Blotting显示其在钙化瓣膜组织和狭窄瓣膜来源的HAVICs中大量表达，而在正常皮肤成纤维细胞中几乎检测不到。免疫组化显示，Wnt5b在正常瓣膜中免疫反应性很低，但在严重钙化瓣膜中染色最强，广泛表达于钙化灶内及周围、炎症区域（巨噬细胞）、脂质区域、广泛纤维化区域、增厚的瓣膜以及活化的VICs和成骨细胞样细胞中。其表达与CD68（巨噬细胞标志）、α-SMA（肌成纤维细胞标志）、骨桥蛋白、β-连环蛋白、BMP2等共定位。半定量分析表明，Wnt5b染色强度与钙化、纤维化、炎症、脂质和新生血管形成呈显著正相关。 * Wnt11：Western Blotting显示其在瓣膜组织和HAVICs中大量表达。免疫组化显示其在钙化瓣膜中染色强烈，特别是在钙化灶、巨噬细胞、纤维化区域和微血管中。其表达强度与钙化、脂质、新生血管形成显著正相关，与纤维化弱相关，与炎症无显著相关。Wnt5b与Wnt11的免疫染色评分之间存在显著相关性。 * Wnt5a：免疫染色显示其在正常瓣膜中很少或没有明显免疫反应性，仅在钙化灶内及周围的炎症细胞和一些活化的肌内膜细胞中有局灶性强染色。 * 临床相关性：Wnt5b和Wnt11的免疫染色评分与更严重的瓣膜狭窄临床指标（更小的主动脉瓣面积、更高的主动脉射流速度、更高的跨瓣压差）呈显著正相关。Wnt5b评分还与更高的手术风险评分（Parsonnet评分）和HbA1c水平正相关。这些结果表明Wnt5b和Wnt11的表达与疾病严重程度密切相关。
2. 非经典Wnt配体诱导HAVICs凋亡和钙化。 * 细胞增殖与凋亡：在OSM中，rhWnt5a和rhWnt5b处理48小时可显著降低HAVICs增殖；处理3周后，所有三种rhWnts均显著降低细胞增殖。更重要的是，三种rhWnts处理4小时和24小时均能显著增加HAVICs的凋亡（通过Annexin V染色和Caspase-3/7活性证实）。 * 诱导钙化：在OSM中培养3周后，所有三种rhWnts均能显著增加来自非钙化瓣膜的HAVICs的钙沉积和钙结节形成。rhWnt5a和rhWnt11联合处理显示出协同效应。 * 羟基磷灰石形成与拉曼光谱验证：这是本研究的关键发现之一。拉曼光谱分析确认，只有在经rhWnts处理的HAVICs中才检测到明显的960 cm⁻¹特征峰，表明形成了羟基磷灰石。定量分析显示，经rhWnt5a和rhWnt11处理的细胞，其羟基磷灰石沉积量显著增加，其中Wnt11处理组的沉积量甚至高于人类钙化瓣膜组织中的水平。结晶度分析表明，Wnt处理的HAVICs中沉积的羟基磷灰石与钙化人类主动脉瓣中的沉积物结晶度相同，但低于生理性硬组织（骨骼、牙釉质）和合成羟基磷灰石，表明这是一种病理性/异位性钙化。 * 对成骨基因表达的影响：rhWnts处理改变了HAVICs中多种成骨相关基因的表达。例如，在非钙化HAVICs中，rhWnt5b上调了骨桥蛋白、平滑肌肌球蛋白重链11等基因；rhWnt11上调了骨桥蛋白、骨钙素、RUNX2、TGFβ等基因。在钙化瓣膜来源的HAVICs中，不同Wnt配体也引起了BMP2、胶原蛋白等基因表达的差异性变化。
3. 非经典Wnt配体通过特定信号通路介导其促钙化效应。 * 信号激活：Western Blotting显示，用rhWnts处理HAVICs可显著增加JNK1/2/3、AKT1和p38 MAPK的磷酸化水平，其中rhWnt5a的效应最强。狭窄的主动脉瓣组织中也显示磷酸化p38和JNK水平升高。 * 通路抑制验证：使用p38 MAPK抑制剂（SB203580）或GSK3β抑制剂（CHIR99021）处理，能显著减少HAVICs的钙沉积。相反，ERK1/2抑制剂（PD184352）则显著增加了钙沉积。mTOR抑制剂（SP600125）与三种rhWnts联合使用时，对钙沉积有协同增强作用，而JNK抑制剂（雷帕霉素）则无此效应。这些结果表明，p38 MAPK和GSK3β信号通路可能参与了非经典Wnt诱导的钙化过程。
第五部分：研究结论与意义
本研究得出结论：非经典Wnt信号通路，特别是Wnt5b和Wnt11，在人类主动脉瓣钙化的发病机制中扮演着潜在的重要角色。
科学价值： 1. 机制新见解：研究首次系统性地将非经典Wnt配体（Wnt5a、Wnt5b、Wnt11）与人类主动脉瓣钙化直接联系起来，拓宽了对Wnt信号通路在瓣膜疾病中作用的认识，超越了此前主要关注的经典Wnt通路。 2. 病理关联性：证明了Wnt5b和Wnt11在钙化瓣膜中特异性高表达，并定位于关键的病理区域（钙化灶、炎症细胞、纤维化区域），且其表达水平与疾病的临床严重程度相关，提示它们可能作为疾病进展的生物标志物或治疗靶点。 3. 功能验证：通过体外实验证实，这三种非经典Wnt配体能够直接诱导人类主动脉瓣间质细胞发生凋亡和病理性钙化（形成羟基磷灰石），并初步揭示了其下游可能涉及p38 MAPK和GSK3β信号通路。 4. 二叶瓣特异性线索：发现Wnt5b在钙化BAV中表达高于TAV，为理解这种常见先天性畸形的加速钙化机制提供了新的研究方向。
应用价值与展望：主动脉瓣钙化目前缺乏有效的药物治疗手段。本研究提示，干扰非经典Wnt信号通路（例如，通过靶向Wnt5b或Wnt11或其下游效应分子）可能为开发减缓或阻止主动脉瓣钙化/狭窄进展的新型疗法提供思路。此外，Wnt5b与手术风险评分（Parsonnet评分）的相关性提示其可能具有预后判断价值。
第六部分：研究亮点
第七部分：其他有价值内容
研究在讨论部分提出了一个有趣的“机械-生物学反馈”可能性：观察到Wnt表达与跨瓣压差（机械力）正相关，结合文献中机械刺激可增加成骨细胞Wnt产生的报道，作者推测瓣膜承受的压力增加可能刺激Wnt产生，进而通过激活VICs介导病理性钙化。这为理解血流动力学应力如何转化为细胞生物学响应提供了潜在连接点。此外，研究还探讨了Wnt信号与细胞外基质（胶原蛋白）代谢改变之间的可能联系，为未来研究指明了更广泛的方向。