小鼠膀胱PDGFRα阳性间质细胞是成纤维细胞：基于超微结构、基因表达和标记物分析的研究报告

一、 研究作者、机构与发表信息

本研究由美国匹兹堡大学（University of Pittsburgh）医学院和细胞生物学系的Dennis R. Clayton、Wily G. Ruiz、Marianela G. Dalghi、Nicolas Montalbetti、Marcelo D. Carattino和Gerard Apodaca（通讯作者）共同完成。研究论文《Studies of ultrastructure, gene expression, and marker analysis reveal that mouse bladder PDGFRα+ interstitial cells are fibroblasts》于2022年7月14日在线发表于《美国生理学杂志：肾脏生理学》（American Journal of Physiology-Renal Physiology）上，卷号为323，页码为F299-F321。

二、 学术背景与研究目的

1. 主要科学领域： 本研究属于膀胱组织生物学、细胞生物学和泌尿系统生理学领域，聚焦于膀胱壁结缔组织中的关键细胞成分——成纤维细胞。

2. 研究背景与动机： 成纤维细胞是器官和组织正常生理与病理过程中的核心细胞，它们合成、组织和重塑细胞外基质（ECM），并释放细胞因子、生长因子等信号分子，参与伤口愈合、免疫调节以及纤维化、癌症等病理过程。然而，对于膀胱壁中的成纤维细胞，我们缺乏基本的认识。长期以来，膀胱壁结缔组织中的一类细胞被称为“间质细胞”，也被交替称为肌成纤维细胞、间质细胞或Cajal样细胞等。这些细胞表达成纤维细胞相关标记物PDGFRα（血小板源性生长因子受体α），同时常与VIM（波形蛋白）和CD34共表达，但其确切的身份和功能一直是个谜。尽管近期基因组图谱研究提示小鼠和人类膀胱中可能存在多个成纤维细胞群，但这些细胞群的验证尚不完整。此外，关于这些细胞是否表达胃肠道起搏细胞（间质Cajal细胞，ICC）的标志物KIT存在长期争议，这进一步模糊了其身份界定。因此，明确这些PDGFRα阳性细胞的身份，对于理解膀胱的正常功能和功能障碍至关重要。

3. 研究目的： 本研究旨在利用最新的成纤维细胞转录组学见解，结合超微结构分析、基因表达谱和蛋白质标记物检测，系统性地验证一个核心假设：小鼠膀胱中表达PDGFRα的间质细胞实际上是成纤维细胞。并进一步探究这些细胞是否构成膀胱壁中不同的区域性亚群。

三、 详细研究流程

本研究采用多学科交叉的方法，整合了形态学、分子生物学和细胞生物学技术，工作流程严谨且系统。

1. 实验动物与模型： * 主要研究对象： 使用8-12周龄的野生型雌性C57BL/6J小鼠。 * 报告基因小鼠： 使用Pdgfrah2b-EGFP报告小鼠，该小鼠的Pdgfra基因位点被替换为核定位的H2B-EGFP，用于可视化表达Pdgfra的细胞。 * 谱系示踪小鼠： 使用Col1a2Cre-ERT; Rosa26mTmG小鼠。在成年期给予他莫昔芬诱导后，表达Col1a2的细胞及其后代将从表达膜结合tdTomato（红色）永久切换到表达膜结合EGFP（绿色），用于追踪胶原蛋白I型α2链表达细胞。

2. 实验方法与流程： * 超微结构分析： * 场发射扫描电镜（FESEM）： 采用碱性浸渍技术处理膀胱组织，选择性去除细胞和非纤维性ECM成分，仅保留纤维状胶原网络，以高分辨率揭示膀胱壁内胶原基质的空间结构。 * 透射电镜（TEM）： 对常规制备的膀胱组织超薄切片进行观察，详细描述结缔组织中细胞的形态特征，如细胞形状、细胞器（粗面内质网、高尔基体）、细胞间连接、与基底膜的关系以及与邻近细胞（如平滑肌细胞、神经末梢）的相互作用。 * 免疫金标记冷冻电镜： 对Pdgfrah2b-EGFP小鼠的膀胱组织进行超薄冷冻切片，使用抗GFP抗体进行免疫金标记，在超微结构水平直接确认具有成纤维细胞形态的细胞是否表达Pdgfra报告基因。

• 基因与蛋白表达分析：

  • 免疫荧光染色与共聚焦显微镜： 对冰冻切片或全铺片组织进行多重免疫荧光染色。使用了大量经过验证的抗体（见表1），检测包括PDGFRα、VIM、CD34、ACTA2（α-平滑肌肌动蛋白）、TNC（腱糖蛋白）、CAR3（碳酸酐酶3）、LY6A（干细胞抗原-1）、PI16（蛋白酶抑制剂16）、MYH11（平滑肌肌球蛋白重链）、KRT5/KRT20（上皮角蛋白）、PECAM1（CD31，内皮标记）、PTPRC（CD45，免疫细胞标记）、UCHL1（神经标记）、CSPG4（NG2，周细胞标记）以及KIT（CD117）在内的多种标记物。通过共聚焦显微镜进行高分辨率成像和三维重建。
  • 荧光原位杂交结合免疫检测（FISH-ID）： 这是一种高灵敏度的方法，用于在单细胞水平同时检测特定mRNA和蛋白质。本研究使用RNAScope技术检测了*Col1a2*、*Col15a1*、*Pi16*、*Pdgfra*和*Kit*的mRNA表达，并与PDGFRα等蛋白质的免疫荧光信号进行共定位分析。
  • 组织细胞计量学： 使用Volumetric Tissue Exploration and Analysis（VTEA）软件对共聚焦Z-栈图像进行定量分析。该软件能自动识别细胞核，并计算每个核周围特定荧光通道的平均强度，生成类似于流式细胞术的散点图，用于量化不同标记物（如PDGFRα与CD34、LY6A等）的共表达情况，并计算共定位系数。

• 数据处理与分析：

  • 图像处理： 使用Adobe Photoshop和Illustrator进行图像对比度调整和排版。
  • 定量统计： 组织细胞计量学数据以平均值±标准差表示。
  • 逻辑关联： 研究流程具有明确的递进逻辑：首先通过超微结构确定候选细胞的形态学特征；然后利用报告基因和免疫标记在光镜水平定位PDGFRα阳性细胞并排除其他细胞类型；接着通过FISH-ID和蛋白染色验证其成纤维细胞相关基因/蛋白的表达谱；最后通过组合标记物分析区分不同的亚群。

四、 主要研究结果

1. 超微结构证实小鼠膀胱壁存在典型的成纤维细胞： * 扫描电镜结果： 碱性浸渍后，膀胱壁显示出密集的纤维状胶原网络。在粘膜下层（紧邻尿路上皮下方），胶原纤维紧密排列成层状编织结构；在外层固有层（更深处），胶原网络较为疏松；在肌肉层间（肌间区域），胶原构成包裹平滑肌束（肌束膜）和单个肌细胞（肌内膜）的结缔组织。 * 透射电镜结果： 在整个膀胱壁的结缔组织中（粘膜下层、外层固有层、肌间区域、浆膜下），存在大量具有典型成纤维细胞超微结构特征的细胞：纺锤形；无基底膜；细胞质中含有丰富的粗面内质网和明显的高尔基体；细胞核呈不规则长形，异染色质边集。这些细胞伸出细长的细胞突起（宽150-400纳米，长可达100微米）。关键发现是，这些细胞之间通过同型细胞间粘附连接相互接触，但未观察到它们与尿路上皮基底层、神经末梢、平滑肌细胞或血管壁细胞形成异型连接。这从形态上确立了它们作为独立结缔组织细胞群的身份。

2. PDGFRα阳性细胞具备成纤维细胞的分子特征： * 定位与形态： Pdgfrah2b-EGFP报告小鼠和PDGFRα免疫染色显示，阳性细胞分布在四个区域：粘膜下层（3-5层，平行于管腔排列）、外层固有层、平滑肌束之间的肌间区域、以及最外层的浆膜下区域。其整体分布和形态与TEM观察到的成纤维细胞完全吻合。免疫金电镜直接证实，具有成纤维细胞超微结构的细胞核确实表达Pdgfra报告基因。 * 排除其他细胞类型： 组织细胞计量学显示，PDGFRα阳性细胞与尿路上皮标记（KRT5/KRT20）、内皮标记（PECAM1）、平滑肌标记（MYH11）的共定位系数极低，表明它们不是这些细胞类型。虽然部分免疫细胞（CD45+）也表达PDGFRα（可能是纤维细胞），但绝大多数PDGFRα+细胞是CD45-的。 * 表达成纤维细胞标志物： * 经典标志物： 这些细胞表达VIM、CD34（粘膜下层细胞除外）以及LY6A（主要在固有层区域）。 * 胶原表达： Col1a2Cre-ERT谱系示踪和FISH-ID均证实，PDGFRα阳性细胞表达*Col1a2*（胶原蛋白I型α2链），这是成纤维细胞的经典功能标志。 * 通用成纤维细胞基因： 这是本研究的关键发现之一。根据最新转录组学研究，*Col15a1*和*Pi16*被定义为两种普遍的成纤维细胞亚型标志。FISH-ID结果显示： * 粘膜下层成纤维细胞：表达*Col15a1*，但不表达*Pi16*。 * 外层固有层成纤维细胞：同时表达*Col15a1*和*Pi16*。 * 肌间和浆膜下成纤维细胞：呈现混合表达模式，有的表达*Col15a1*和*Pi16*，有的只表达*Col15a1*，少数只表达*Pi16*。部分平滑肌细胞也表达*Col15a1*，但不表达PDGFRα。 * 不表达ICC标志物KIT： 使用公认有效的ACK2抗体，能在小鼠结肠中清晰检测到KIT+的ICC，但在膀胱中几乎检测不到KIT蛋白。FISH检测发现膀胱肌层有少量Kit mRNA信号，但FISH-ID证实这些信号主要与MYH11+的平滑肌细胞相关，而非PDGFRα+的成纤维细胞。这有力地反驳了膀胱PDGFRα+细胞是ICC样细胞的假说。

3. 小鼠膀胱壁存在四个区域特异性的成纤维细胞亚群： 基于上述标记物的组合表达模式，研究团队定义了四个不同的成纤维细胞群体： * 粘膜下层成纤维细胞：表达PDGFRα, VIM, ACTA2（低水平）， CAR3, TNC, LY6A, MYH10， Col1a2, *Col15a1*；不表达CD34和*Pi16*。 * 外层固有层成纤维细胞：表达PDGFRα, VIM, CD34, LY6A, Col1a2, Col15a1, *Pi16*（蛋白水平也证实）。 * 肌间成纤维细胞：表达PDGFRα, VIM, CD34, Col1a2, Col15a1, *Pi16*（部分细胞）。 * 浆膜下成纤维细胞：表达PDGFRα, VIM, CD34, Col1a2, Col15a1, *Pi16*（部分细胞）。 此外，研究还发现CSPG4（NG2）主要标记血管周细胞和部分外层平滑肌细胞，与PDGFRα+成纤维细胞重叠很少。

五、 研究结论与意义

结论： 本研究通过综合性的超微结构、分子表达和标记物分析，提供了确凿的证据表明，小鼠膀胱中表达PDGFRα的“间质细胞”实际上就是成纤维细胞。它们不具备ICC的特征（不表达KIT），而是具备所有成纤维细胞的形态学和分子标志。更重要的是，研究首次系统性地鉴定并描述了膀胱壁中存在四个解剖位置和分子表型各异的成纤维细胞亚群。

科学价值： 1. 澄清了长期存在的细胞身份争议： 将膀胱壁结缔组织中的主要细胞成分明确归类为成纤维细胞，并否定了其作为ICC样起搏细胞的主流假说，为领域建立了新的认知框架。 2. 提供了详细的细胞图谱： 不仅确认了成纤维细胞的身份，还绘制了其详细的区域分布图和分子特征谱，包括经典标记物和最新的通用成纤维细胞基因标记（Col15a1, *Pi16*）。这为未来研究提供了关键的参考标准和工具。 3. 奠定了功能研究的基础： 不同亚群的发现提示膀胱不同区域的成纤维细胞可能具有特异性的功能，例如粘膜下层的成纤维细胞可能更多参与上皮下信号微环境的构建和免疫调节，而肌间的成纤维细胞可能更直接地影响平滑肌的机械性质和神经支配。这为探索成纤维细胞在膀胱充盈、排空、感觉传导、以及纤维化、过度活动症、间质性膀胱炎等病理过程中的特异性作用指明了方向。

六、 研究亮点

1. 多维度验证策略： 研究没有依赖单一技术，而是整合了从纳米级超微结构到基因转录和蛋白表达的多层次证据，使得结论非常坚实。
2. 引入前沿的分子定义： 率先在膀胱研究中应用并验证了“通用成纤维细胞基因”（*Col15a1*和*Pi16*）这一最新转录组学概念，使细胞分类更具时代性和可比性。
3. 高分辨率空间定位技术： 广泛应用FISH-ID技术，实现了mRNA与蛋白在组织原位的高精度共定位，克服了单纯免疫染色或批量转录组测序空间分辨率不足的局限。
4. 定量化组织分析： 采用VTEA软件进行组织细胞计量学分析，为标记物共表达提供了客观的定量数据，增强了结果的说服力。
5. 明确的亚群划分： 超越了将膀胱成纤维细胞视为均质群体的传统观点，首次明确提出了基于解剖位置和分子标志的四个亚群，极大地细化了该领域的认知。

七、 其他有价值的内容

研究中对实验方法的描述极为详尽，尤其是碱性浸渍-扫描电镜技术、免疫金冷冻电镜技术和FISH-ID protocol，为其他研究者进行类似的组织微观结构及分子定位研究提供了宝贵的技术参考。此外，研究团队对所用抗体的来源、克隆号和工作稀释度进行了完整列表（表1），体现了研究的可重复性和严谨性。研究还讨论了膀胱平滑肌细胞自身表达胶原蛋白的可能性，并对谱系示踪中他莫昔芬诱导效率的局限性保持了客观认识，展现了科学的审慎态度。