《超低温非冷冻保存人类肝脏：一项突破性器官保存技术的详细协议》学术报告

一、研究团队与发表信息
本研究由哈佛医学院与麻省总医院工程医学中心（Center for Engineering in Medicine）的Reinier J. de Vries、Shannon N. Tessier、Korkut Uygun等学者主导，联合阿姆斯特丹大学医学中心（Amsterdam University Medical Centers）等机构合作完成，于2020年6月发表于期刊*Nature Protocols*（2020;15(6):2024–2040），标题为《Sub-zero non-frozen preservation of human livers in the supercooled state》。

二、学术背景与研究目标
科学领域：本研究属于器官移植与低温生物保存（cryopreservation）交叉领域，聚焦于解决肝脏移植中器官保存时间短的核心瓶颈。

研究背景：
1. 临床需求：目前临床采用4°C静态冷保存（static cold storage, SCS），肝脏最长保存时间仅12小时，导致器官废弃率高、匹配效率低。
2. 低温保存挑战：传统冷冻（<-80°C）会因冰晶形成（ice formation）损伤细胞，而超冷保存（supercooling，-4°C无冰状态）可抑制代谢且避免冰晶损伤，但体积依赖性冰核化（volume-dependent ice nucleation）限制了其在人类大器官中的应用。
3. 前期基础：团队此前在大鼠肝脏中验证超冷保存可将存活时间延长至72小时（Nature Medicine 2014），但人类肝脏体积增大200倍，技术需重新优化。

研究目标：开发适用于人类肝脏的超冷保存协议，实现-4°C下无冰保存，并验证其 ex vivo（离体）可行性。

三、实验流程与创新方法
总体设计：协议分为7个核心步骤，耗时31小时（含20小时超冷存储），基于多温度机器灌注（machine perfusion）和冷冻保护剂（cryoprotective agents, CPAs）预处理。

详细流程：
1. 肝脏预处理（3小时）：
- 研究对象：5例临床废弃人类肝脏（来自New England Donor Services）。
- 方法：采用亚常温机器灌注（subnormothermic machine perfusion, SNMP，21°C）恢复肝脏能量，灌注液中添加3-O-甲基-D-葡萄糖（3-OMG）以抑制细胞内冰晶形成。

1. 低温灌注与CPA加载（1小时）：

   • 创新配方：使用改良UW溶液（University of Wisconsin solution）补充聚乙二醇（PEG-35kDa）、海藻糖（trehalose）和甘油（glycerol），通过梯度降温（21°C→4°C）实现均匀渗透。
     

2. 超冷存储（20小时，-4°C）：

   • 技术突破：设计无气液界面（air-liquid interface）的密封袋，减少冰核化位点；使用定制冷却槽（supercooling chiller）维持温度均一性。
     

3. 复温与CPA清除（3小时）：

   • 安全性验证：通过SNMP逐步复温，监测腺苷酸能量电荷（adenylate energy charge）和胆汁产量等指标。
     

关键创新：
- 多温度灌注系统：自主开发的双循环灌注装置（图2a），集成温度调节与压力监测模块，支持从SNMP到低温灌注的切换。
- 抗冻保护剂组合：首次在人类器官中验证PEG-35kDa+海藻糖+甘油的协同效应，降低组织冻结温度至-4°C以下。

四、主要结果与科学逻辑
1. 能量代谢恢复：
- 超冷保存后肝脏能量电荷恢复率达80%（图5a），显著优于传统冷保存（p<0.05），证实代谢抑制的可逆性。

1. 功能完整性：

   • 胆汁生产：5例肝脏中4例术后胆汁产量与预处理无差异（图5b），提示胆管功能完整。
     
   • 氧耗与乳酸清除：复温后氧摄取率（oxygen uptake rate）稳定（图5c），乳酸水平较预处理降低（p=0.004，图5d），反映线粒体功能恢复。
     

2. 无冰晶损伤证据：

   • 血管阻力（vascular resistance）与转氨酶（AST/ALT）水平未升高（图5e-f），排除冰晶或CPA毒性损伤。
     

逻辑链条：通过机器灌注优化CPA加载→超冷抑制代谢→复温恢复功能，形成闭环技术路径。

五、结论与价值
科学意义：
1. 首次实现人类大体积器官超冷保存，突破体积依赖性冰核化限制，为其他实体器官（如肾脏、心脏）保存提供范式。
2. 提出“代谢抑制-功能恢复”协同理论，深化对低温生物学（cryobiology）的理解。

应用价值：
- 将肝脏离体保存时间延长至27小时，为跨地域器官共享创造条件。
- 技术可整合至现有临床灌注设备（如HMP/NMP），转化门槛低。

六、研究亮点
1. 方法学创新：
- 多温度灌注协议（SNMP→HMP→超冷）实现CPA梯度加载与清除。
- 无气液界面密封技术降低冰核化风险。
2. 临床前验证：
- 使用临床废弃肝脏模型，数据更具 translational（转化）价值。

局限性：需大动物移植实验验证长期存活率，且运输中振动对超冷稳定性的影响待评估。

七、其他价值
- 专利与产业化：团队已申请临时专利，Korkut Uygun创立Organ Solutions公司推动技术商业化。
- 伦理合规性：研究通过麻省总医院IRB审批，遵循《赫尔辛基宣言》和《伊斯坦布尔宣言》。

（注：文中所有专业术语首次出现时均标注英文原名，如“亚常温机器灌注（subnormothermic machine perfusion, SNMP）”）