Dimethyl Malonate通过抑制FTH1介导的铁蛋白自噬保护新生儿缺氧缺血性脑损伤的神经行为表型——学术研究报告

作者及发表信息

本研究由苏州大学附属儿童医院儿科研究所脑科学系的Yiming Jin、Xinxin Wang、Xiaowen Xu（共同第一作者）及Hong Ni（通讯作者）团队主导，合作单位包括苏州市吴江区儿童医院儿科研究实验室。研究成果发表于Redox Biology期刊（2025年7月，第86卷，文章编号103792），遵循CC BY-NC开源许可协议。

学术背景

研究领域与动机
新生儿缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-Ischemic Brain Damage, HIBD）是导致新生儿神经损伤和死亡的主要原因，现有临床干预手段效果有限。近年研究发现，铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡形式）是HIBD的关键病理机制之一，而铁蛋白自噬（ferritinophagy，通过自噬降解铁储存蛋白ferritin释放Fe²⁺）可能加剧这一过程。Dimethyl Malonate（DMM）作为琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase, SDH）的竞争性抑制剂，在多种神经系统疾病模型中表现出神经保护作用，但其在新生儿HIBD中的机制尚未明确。本研究旨在探索DMM通过调控铁代谢和铁蛋白自噬抑制铁死亡的神经保护机制。

科学基础
- 铁死亡与HIBD：新生儿脑内游离铁水平较高，缺氧缺血导致Fe²⁺积累，通过芬顿反应产生活性氧（ROS），引发脂质过氧化和神经元死亡。
- DMM的潜在作用：DMM可减少缺血组织中的琥珀酸积累，抑制线粒体ROS产生，且既往研究表明其能通过非琥珀酸依赖途径（如铁螯合）发挥保护作用。

实验流程与设计

1. 体内实验：新生儿HIBD小鼠模型

• 动物与分组：10日龄雄性C57BL/6J小鼠分为假手术组（Sham）、HIBD模型组、HIBD+DMM治疗组（剂量2.5–20 mg/kg）。样本量依据实验类型调整（如Nissl染色n=6，行为学n=8）。
  
• 模型建立：改良Vannucci法——结扎右颈总动脉后暴露于8%氧气2小时，模拟缺氧缺血。DMM于术前15分钟腹腔注射。
  
• 评估方法：
  
  • 脑梗死体积：TTC染色定量缺血区域（ImageJ分析）。
    
  • 神经元存活：Nissl染色计数皮层和海马区Nissl阳性神经元。
    
  • 行为学测试（术后4-5周）：悬崖回避反射、负趋地性反射、前肢抓握反射、翻身反射评估神经发育；旷场实验（OFT）测探索行为；新物体识别（NOR）测认知记忆；步态错误测试（Foot-fault）评估运动协调。
    
  • 铁死亡标志物：检测皮层Fe²⁺含量（铁测定试剂盒）、MDA（丙二醛）和4-HNE（脂质过氧化产物）；Western blot分析抗氧化通路（SLC7A11/GPX4）及铁蛋白自噬相关蛋白（NCOA4、FTH1、p62、LC3II）。
    
  • 蛋白互作验证：Co-IP检测NCOA4-FTH1相互作用。
    

2. 体外实验：HT22细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型

• 细胞处理：HT22神经元细胞分为对照组（Con）、OGD/R组、OGD/R+DMM组（2.5 mM预处理）。
  
• 关键实验：
  
  • 细胞活力：CCK-8法测定DMM最佳干预浓度。
    
  • 铁死亡指标：FerroOrange荧光探针测Fe²⁺；MDA检测脂质过氧化；Western blot分析GPX4/SLC7A11及自噬标志物。
    
  • FTH1基因沉默：siRNA转染验证DMM作用依赖性。
    
  • 细胞器水平机制：免疫荧光观察FTH1与溶酶体标记物LAMP2共定位；FerroOrange/LysoTracker双染色测溶酶体Fe²⁺积累。
    

主要结果

1. DMM减轻HIBD病理损伤

   • 脑梗死体积：10 mg/kg DMM使梗死面积减少约50%（p<0.001）。
     
   • 神经元保护：DMM显著增加皮层和海马区Nissl阳性神经元数量（p<0.01），改善细胞形态。
     

2. 行为学改善

   • DMM治疗组在神经反射测试（如翻身反射时间缩短，p<0.05）、OFT（中心区域探索时间增加，p<0.01）及NOR（辨别指数提高，p<0.05）中表现优于HIBD组。
     

3. 抑制铁死亡

   • 铁代谢：DMM降低皮层Fe²⁺水平（减少~30%，p<0.01）及MDA/4-HNE（p<0.001）。
     
   • 抗氧化通路：DMM上调SLC7A11和GPX4表达（p<0.01）。
     

4. 靶向铁蛋白自噬

   • 蛋白表达：DMM下调NCOA4/LC3II，上调FTH1/p62（p<0.05）。
     
   • 机制验证：Co-IP显示DMM削弱NCOA4-FTH1结合（p<0.05）；FTH1沉默后DMM保护作用消失，证实其依赖性。
     

5. 溶酶体铁调控

   • 免疫荧光显示DMM减少FTH1-LAMP2共定位（Pearson系数降低，p<0.01），抑制溶酶体Fe²⁺释放（FerroOrange信号减弱，p<0.05）。
     

结论与价值

1. 科学意义：首次阐明DMM通过破坏NCOA4-FTH1互作抑制铁蛋白自噬，减少Fe²⁺释放，从而阻断铁死亡的新机制，为HIBD治疗提供新靶点。
   
2. 应用价值：DMM作为可穿透血脑屏障的小分子化合物，具有临床转化潜力，尤其针对铁代谢紊乱相关神经疾病。
   

研究亮点

• 创新性发现：揭示DMM通过非琥珀酸依赖途径（铁代谢调控）发挥神经保护作用。
  
• 方法学优势：结合体内外模型、多模态行为学评估及细胞器水平机制解析，系统性验证假说。
  
• 临床相关性：突破DMM传统“缺血前给药”时间窗限制，为扩展治疗时机提供实验依据。
  

局限与展望
需进一步探索DMM在缺血后给药的可行性及长期神经保护效果，并验证其在其他铁死亡相关疾病（如神经退行性疾病）中的普适性。