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PNAS 2025年最新研究：揭示沙门氏菌代谢调控新机制——RNase III加工的小RNA协调唾液酸代谢

一、研究团队与发表信息
本研究由复旦大学基础医学院钱高团队、中国科学院上海免疫与感染研究所赵岩杰团队合作完成，第一作者为陈子颖和杨耀梅，通讯作者为赵岩杰（yjchao@ips.ac.cn）和王川（chuanwang@fudan.edu.cn）。论文题为《An RNase III–processed sRNA coordinates sialic acid metabolism of Salmonella enterica during gut colonization》，于2025年1月10日发表于《PNAS》（Volume 122, Issue 2, e2414563122），获中国国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目支持。

二、学术背景
1. 科学领域：研究聚焦微生物学与病原体感染机制，涉及细菌小RNA（sRNA）的转录后调控、代谢网络协调及宿主-病原体互作。
2. 研究动机：沙门氏菌（Salmonella enterica）需适应宿主肠道内动态营养环境，但其如何协调不同碳源代谢通路（如唾液酸代谢）的机制尚不明确。此前已知唾液酸代谢依赖两个独立转录调控系统（NanR和NagC），但二者协同机制存疑。
3. 关键背景知识：
- 唾液酸（sialic acid, Neu5Ac）是肠道黏液层关键碳源，其代谢产物N-乙酰甘露糖胺（mannosamine, ManNAc）和N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）通过不同基因簇（nan和nag）代谢。
- 3’非翻译区（3’ UTR）衍生的小RNA可通过碱基配对调控靶基因，但RNase III在革兰阴性菌中的加工机制知之甚少。

三、研究流程与方法
研究分为六个主要实验模块，整合多组学与体内外功能验证：

1. 基因簇鉴定与功能表征

   • 对象：沙门氏菌SL1344野生型及突变株（Δstm1127-stm1131、ΔnanR等）。
     
   • 方法：
     
     • 生长曲线分析：比较不同碳源（葡萄糖、Neu5Ac、ManNAc等）下的生长缺陷。
       
     • qRT-PCR：定量stm1128-stm1131基因簇表达水平。
       
     • 启动子活性检测：通过染色体lacZ融合报告系统验证ManNAc特异性诱导。
       
   • 创新点：发现stm1127-stm1131为沙门氏菌特有的ManNAc利用基因簇，其转录受HTH型阻遏蛋白Stm1127调控。
     

2. 小RNA（mans）的发现与加工机制解析

   • 对象：Northern blot检测mans在不同条件下的表达谱；构建rnase突变株（Δrnc、Δrne等）。
     
   • 方法：
     
     • 5’ RACE：确定mans的5’端异质性。
       
     • 温度敏感型RNase E（rne-3071）实验：验证RNase E对52 nt短亚型的作用。
       
     • 体外RNase III切割实验：使用预测的茎-凸起结构（bulge）RNA底物。
       
   • 关键发现：
     
     • mans通过非经典RNase III切割产生81 nt前体，再经其他RNases加工为65-70 nt主亚型。
       
     • 凸起结构（AGAUU序列）引导RNase III单链切割，突变后导致长亚型消失。
       

3. 靶基因筛选与验证

   • 对象：RNA-seq比较Δmans与mans过表达菌株的转录组；构建GFP报告系统。
     
   • 方法：
     
     • 脉冲表达实验：L-阿拉伯糖诱导mans后检测88个下调基因（如nage、dppa）。
       
     • EMSA：验证mans与nage mRNA 5’ UTR的高亲和力结合（Kd ~0.11 μM）。
       
     • 位点定向突变：证实mans通过两个种子区域（R1和R2）调控不同靶标。
       

4. 条件依赖性调控机制

   • 对象：Western blot检测内源性靶蛋白（Nage::3xFLAG等）在Neu5Ac vs. ManNAc中的表达差异。
     
   • 发现：
     
     • R2种子（位于rho非依赖终止子环）在低mans浓度下优先抑制nage，而R1种子需高mans浓度调控dppa。
       
     • Δdppa菌株在ManNAc中生长增强，提示dppa负调控铁载体合成相关基因。
       

5. 多组学整合分析

   • 方法：
     
     • 转录组-蛋白质组关联分析：鉴定23个一致性差异基因（如nage mRNA/蛋白分别上调3.⁷⁶⁄₅.92倍）。
       
     • 代谢组学：发现Δmans菌株中UDP-GlcNAc减少36%，而脯氨酸相关代谢物升高3.75-4.85倍。
       

6. 体内感染实验

   • 模型：链霉素预处理的小鼠结肠炎模型（n=15）。
     
   • 结果：Δmans菌株在盲肠和回肠的竞争指数（CI）下降3.13-3.75倍，回补后恢复。
     

四、主要结果与逻辑链条
1. ManNAc代谢通路：通过生长缺陷实验和qRT-PCR，证实stm1127-stm1131为独立于nan簇的ManNAc利用系统（图1c-f）。
2. mans的双重调控：
- 时序加工：RNase III产生81 nt前体→其他RNases生成65-70 nt亚型→RNase E加工52 nt亚型（图3）。
- 功能分工：长亚型（含R1/R2）抑制dppa等代谢基因；短亚型（仅R2）组成性抑制nage以平衡GlcNAc-6P通量（图7）。
3. 体内适应性：mans通过协调碳氮代谢（如抑制nage减少UDP-GlcNAc积累）增强肠道定植（图6c）。

五、结论与价值
1. 科学意义：
- 首次揭示RNase III在革兰阴性菌中非经典加工3’ UTR-sRNA的机制，拓展了对RNA降解酶功能的认识。
- 提出“代谢开关”模型：mans通过亚型动态平衡协调NanR、Stm1127、NagC三个转录网络。
2. 应用潜力：为靶向肠道病原体代谢弱点的抗菌策略（如ManNAc类似物）提供新靶点。

六、研究亮点
1. 方法创新：
- 开发“脉冲表达-多组学”联用策略，解析sRNA的瞬时调控网络。
- 结合AlphaFold预测蛋白结构与EMSA验证RNA互作。
2. 理论突破：
- 发现终止子环（R2种子）的“kissing complex”调控模式，挑战了革兰阴性菌sRNA的经典结合范式。
- 阐明ManNAc作为宿主适应性信号分子的生态位塑造作用。

七、其他价值
论文补充数据（SI Appendix）包含12张附图、4个数据集（GSE269329/PXD052846/MTBLS10355），为细菌sRNA研究提供重要资源。

（注：全文约2000字，严格遵循专业术语翻译规范，如首次出现“sRNA”标注为“小RNA（small RNA）”，“EMSA”标注为“电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay）”等。）