Harringtonine通过多重机制抑制寨卡病毒感染
本研究由国立防务医学中心（National Defense Medical Center）药理学系暨三军总医院药学实践科的赖正宗（Zheng-Zong Lai）、国立防务医学中心药学系的何怡蓉（Yi-Jung Ho）以及新加坡国立大学生物科学系的吕政伟（Jeng-Wei Lu）共同完成。何怡蓉与吕政伟为共同通讯作者。该研究发表于Molecules期刊2020年第25卷第4082号，于2020年8月14日投稿，9月6日接收，9月7日正式在线发表。
一、研究背景与目的
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种由蚊媒传播的黄病毒属（Flavivirus）正链单股RNA病毒，与黄热病病毒、登革病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒及日本脑炎病毒同属黄病毒科。寨卡病毒基因组长度约为10,700个核苷酸，编码约3,400个氨基酸，经病毒及宿主细胞蛋白酶水解后产生三个结构蛋白（衣壳蛋白、前膜蛋白和包膜蛋白）与七个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。其中包膜蛋白（envelope protein）负责病毒入侵并影响宿主附着，非结构蛋白则与病毒RNA复制及病毒粒子组装相关。
寨卡病毒于1947年在乌干达森林的恒河猴体内首次被发现。2007年在西太平洋雅浦岛暴发第一次疫情，随后于2015至2016年在中南美洲国家引发大规模流行。该病毒除经受感染的蚊虫传播外，还可通过宫内传播、性传播和输血传播。约80%的感染者无症状或仅出现短暂发热、皮疹、肌肉关节痛、结膜炎和头痛等轻微症状，但寨卡病毒感染与胎儿小头畸形及成人吉兰–巴雷综合征（Guillain–Barré syndrome）等严重神经系统后果密切相关。目前美国食品药品监督管理局（FDA）尚未批准任何针对寨卡病毒感染的药物或疫苗。
Harringtonine（三尖杉酯碱）是从三尖杉属（Cephalotaxus）植物中分离的天然生物碱，与高三尖杉酯碱（homoharringtonine）、异三尖杉酯碱（isoharringtonine）和三尖杉碱（cephalotaxine）结构相似。Harringtonine已显示出抗白血病活性及抗基孔肯雅病毒（CHIKV）、新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）和水痘–带状疱疹病毒（VZV）的抗病毒活性。作者前期研究表明三尖杉碱通过阻碍病毒复制和稳定性而具有抗寨卡病毒活性，但harringtonine是否具有抗寨卡病毒作用尚不明确。因此，本研究旨在系统评价harringtonine对寨卡病毒感染的潜在抑制作用，并阐明其可能的作用机制。
二、研究流程与方法
本研究采用非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）作为寨卡病毒感染的宿主细胞模型，病毒株为PRVABC59。研究流程包括以下主要环节：
细胞毒性评价：采用CCK-8法检测不同浓度harringtonine处理Vero细胞48小时后的细胞活力。结果显示在625 nM浓度下细胞活力仍维持在约90%，在1250 nM浓度下约为83%。为避免药物引起的细胞毒性干扰，后续抗病毒实验的药物浓度限制在650 nM以内。
抗病毒活性测定：Vero细胞以感染复数（MOI）=0.01接种寨卡病毒（每孔1000荧光焦点形成单位，FFU），分别加入156、312和625 nM的harringtonine处理48小时。通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞内病毒RNA水平，通过蛋白质印迹法（Western blot）检测包膜蛋白表达，通过荧光焦点法（fluorescent focus assay, FFA）测定上清液中子代病毒滴度，并通过免疫荧光法（immunofluorescence assay, IFA）观察病毒感染程度。
加药时间实验（time of addition assay）：以MOI=0.1感染Vero细胞，在病毒感染周期的不同阶段加入625 nM harringtonine，分为预处理组（感染前3小时加药）、共处理组（感染开始时加药）、后处理组（感染2小时后加药）和全程处理组。24小时后检测细胞内病毒RNA水平和上清液病毒滴度。此外，在病毒进入细胞后于0、6、12小时加入harringtonine，以确定其对病毒感染晚期阶段的干扰效果。
结合与进入实验：结合实验在4°C条件下进行，此时病毒可结合于细胞表面但不能进入细胞。以MOI=0.1的寨卡病毒与625 nM harringtonine共同接种于Vero细胞4°C孵育1小时，洗涤后换新鲜培养基于37°C培养24小时，检测病毒RNA和滴度。进入实验则先在4°C使病毒结合1小时，去除接种物后加入harringtonine于37°C孵育1小时，再换新鲜培养基培养24小时后检测。
复制与释放实验：细胞在4°C感染1小时后转至37°C孵育1小时使病毒进入细胞，随后加入harringtonine处理。培养1天后收集细胞裂解物以RT-qPCR检测病毒RNA复制水平，上清液以FFU法评估病毒释放情况。
病毒灭活实验（virucidal assay）：将3×10⁴ FFU寨卡病毒分别与0、156、312、625 nM的harringtonine在37°C混合孵育3小时，然后以荧光焦点法测定病毒滴度，评价药物对病毒稳定性的影响。
分子对接分析：从蛋白质数据库（PDB）获取寨卡病毒包膜蛋白晶体结构（5IRE），从ChemSpider数据库获取harringtonine三维配体结构，使用PatchDock软件进行分子对接分析，根据对接评分评估harringtonine与包膜蛋白的结合可能性。
抗日本脑炎病毒活性评价：使用日本脑炎报告病毒rp9-GFP株以MOI=0.01感染Vero细胞，加入不同浓度harringtonine处理48小时，通过RT-qPCR检测病毒RNA水平，通过倒置荧光显微镜观察病毒荧光蛋白表达。
三、主要研究结果
细胞毒性实验表明harringtonine在625 nM浓度下Vero细胞活力仍保持在90%以上，确定该浓度可作为后续实验的安全上限。抗病毒活性实验显示，harringtonine以剂量依赖性方式降低寨卡病毒RNA水平、包膜蛋白表达量和子代病毒产量。IFA结果同样证实harringtonine剂量依赖性地抑制寨卡病毒感染。这些数据表明harringtonine在体外通过抑制寨卡病毒RNA和蛋白的产生以及减少病毒粒子产量来抑制病毒感染。
加药时间实验结果显示，harringtonine在病毒感染周期的各个阶段均能降低病毒RNA水平和子代病毒产量，其中后处理阶段抑制效果最强（病毒RNA水平和子代产量均降低约3个对数级），表明该化合物可能主要作用于寨卡病毒感染的晚期阶段。共处理阶段也观察到明显抑制，提示其对早期感染阶段也有影响。在病毒进入后不同时间点（0、6、12小时）加入harringtonine的结果进一步证实了其对感染晚期阶段的有效干扰作用。
结合实验结果表明，harringtonine能够抑制寨卡病毒与宿主细胞的结合过程，表现为病毒RNA和子代病毒滴度的显著降低。进入实验同样显示harringtonine可阻断病毒进入宿主细胞。复制与释放实验结果显示，harringtonine还能降低病毒RNA复制水平并减少病毒粒子释放。病毒灭活实验中，312 nM和625 nM的harringtonine分别使寨卡病毒感染能力降低约64.5%和93.8%，且呈剂量依赖性，证明其具有直接的病毒灭活能力，能够破坏病毒粒子的稳定性。分子对接分析显示harringtonine与寨卡病毒包膜蛋白具有较高的对接评分（最高PatchDock评分为5978），提示其可能通过与包膜蛋白结合而阻断病毒感染的早期阶段并影响病毒粒子稳定性。此外，预处理阶段的抗病毒效果表明harringtonine可能进入细胞并在感染前发挥预防性抗病毒作用。
抗日本脑炎病毒实验结果显示，156至625 nM的harringtonine对rp9-GFP报告病毒表现出剂量依赖性的抑制作用，病毒RNA水平降低，荧光蛋白表达减少，表明harringtonine具备治疗日本脑炎病毒感染的抗病毒潜力。
四、结论与研究价值
本研究首次系统证明了harringtonine通过多重机制抑制寨卡病毒感染，包括阻断病毒结合、进入、复制和释放，破坏病毒粒子稳定性，以及在感染前发挥预防性抗病毒作用。与作者前期研究的三尖杉碱相比，harringtonine具有更复杂的抗寨卡病毒机制和更高的选择性指数（SI=34.73，三尖杉碱SI=7.5），其半数有效浓度（EC₅₀）为287.94 nM，半数细胞毒性浓度（CC₅₀）大于10 µM。分子对接结果提示harringtonine与寨卡病毒包膜蛋白的结合能力可能是其阻断感染早期阶段并影响病毒稳定性的分子基础。此外，harringtonine对日本脑炎病毒也表现出剂量依赖性的抑制作用，提示三尖杉属生物碱可能对黄病毒具有广谱抗病毒效应。既往研究认为harringtonine的抗病毒机制可能通过抑制真核细胞大核糖体亚基功能从而抑制蛋白质合成来实现，本研究中病毒蛋白表达的降低可能与此相关。
本研究的科学价值在于系统阐明了harringtonine作用于寨卡病毒感染全生命周期的多重抑制机制，为天然生物碱类抗病毒药物的开发提供了新的候选化合物。其应用价值在于，鉴于目前尚无FDA批准的寨卡病毒感染治疗药物，harringtonine作为一种具有明确抗病毒活性和良好安全性记录的天然化合物，有望成为抗寨卡病毒感染治疗药物开发的有利候选。此外，其对日本脑炎病毒的抑制作用提示了三尖杉属生物碱在黄病毒属广谱抗病毒药物研发中的潜在应用前景。
五、研究亮点
本研究的主要亮点包括：第一，首次全面揭示了harringtonine对寨卡病毒感染全生命周期（结合、进入、复制、释放和病毒稳定性）的抑制作用，较既往研究报道的单一机制更为全面和系统；第二，通过分子对接分析预测了harringtonine与寨卡病毒包膜蛋白的结合能力，为理解其早期阶段抑制作用提供了结构层面的解释；第三，发现harringtonine具有感染前预处理保护作用，具有预防性抗病毒应用的潜力；第四，证实了harringtonine对日本脑炎报告病毒的抗病毒活性，拓展了三尖杉属生物碱的抗病毒谱；第五，与三尖杉碱的对比分析表明，尽管两者结构相似，但harringtonine具有更高的选择性指数和更广泛的抗病毒机制，为构效关系研究提供了参考。