本报告基于一项原创性研究，对该研究进行详细介绍。
主要作者及发表信息
该研究由郑州大学第一附属医院心血管外科的Chen Huang、Xun Zhang、Shi-Xiong Wu、Qing Chang、Zhi-Kun Zheng以及通讯作者Jing Xu共同完成。这项研究成果于2025年1月19日在线发表于国际学术期刊《Materials Today Bio》的第31卷，文章编号为101500。
研究背景与研究目的
该研究聚焦于心血管疾病领域的一个重要病理过程——心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI）。MI/RI常见于多种心脏疾病的治疗过程中，当缺血的心肌组织恢复血液灌注时，会引发氧化应激（oxidative stress）反应，反而加剧心肌损伤，导致心功能不全。现有的治疗方法效果有限，因此迫切需要寻找更有效的治疗策略来改善患者预后。
早期生长反应因子1（Early growth response 1, EGR1）是一个关键的转录因子，在MI/RI发生后迅速表达，并促进炎症和凋亡（apoptosis）相关基因的表达，是一个潜在的治疗靶点。小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）可以通过RNA干扰机制沉默特定基因，例如沉默EGR1。然而，如何高效、稳定地将siRNA递送至靶组织是一个难题。
人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）来源的外泌体（exosomes, hUCMSCs-Exo）具有高稳定性和药物递送效率，是理想的药物载体。但外泌体在心肌组织中的滞留率低，直接注射效果不佳。微针（microneedle, MN）贴片是一种新型药物递送系统，能够穿透组织并实现药物的持续释放。因此，本研究旨在开发一种负载了针对EGR1的siRNA（si-EGR1）的hUCMSCs外泌体微针贴片（hUCMSCs-Exosi-EGR1 MN patch），并探究其通过调节氧化应激和线粒体自噬（mitophagy）来保护心肌、改善MI/RI的效果。
研究的详细工作流程
本研究共包含三个主要阶段：治疗性外泌体的构建与表征、体外细胞实验验证、以及体内动物模型实验和应用。
第一阶段：hUCMSCs-exosi-EGR1的构建与表征 研究人员首先对人脐带间充质干细胞进行培养和鉴定。通过光学显微镜观察细胞形态，并通过流式细胞术确认其表面标志物（高表达CD90、CD105、CD73，不表达CD45、CD34等），诱导分化实验证实其具有成骨、成脂和成软骨分化潜能。随后，通过超速离心法从细胞培养上清液中分离出hUCMSCs来源的外泌体（hUCMSCs-Exo），并使用透射电子显微镜（TEM）观察其茶托状形态，动态光散射（DLS）测定其粒径在30-100纳米之间，蛋白质印迹法（Western blot）检测其高表达外泌体标志蛋白CD63和HSP70，不表达内质网蛋白Calnexin。 接着，研究人员采用电穿孔技术，将荧光染料Dil标记的EGR1 siRNA装载入hUCMSCs-Exo中，制备出工程化外泌体hUCMSCs-Exosi-EGR1。通过免疫磁珠捕获结合荧光显微镜观察，确认了siRNA的成功装载。TEM、DLS等表征显示，装载siRNA后外泌体形态未受显著影响，粒径略有增加。血清稳定性实验表明，与裸siRNA相比，封装在外泌体中的siRNA在50%胎牛血清（FBS）中显著更稳定，至20小时仍可被检测到。体外释放实验显示，Exosi-EGR1在PBS中24小时内释放率达到95%。此外，通过CCK-8细胞毒性实验证实，即使在高达500 μg/ml的浓度下，hUCMSCs-Exo和Exosi-EGR1对原代小鼠心肌细胞均无显著毒性，显示了良好的生物安全性。共培养实验也证实心肌细胞能够有效内化这些外泌体。
第二阶段：体外细胞实验——验证hUCMSCs-Exosi-EGR1的保护作用 为了在体外模拟MI/RI，研究人员对原代小鼠心肌细胞进行了氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）处理。实验设置了对照组、OGD/R模型组、OGD/R + hUCMSCs-Exo治疗组、以及OGD/R + Exosi-EGR1治疗组。首先确定了OGD 3小时/复氧4小时为后续实验条件。CCK-8检测显示，Exosi-EGR1治疗能显著提高OGD/R损伤后的细胞活力，且效果优于hUCMSCs-Exo。 在氧化应激方面，Exosi-EGR1处理能显著降低OGD/R引起的细胞内活性氧（ROS）水平升高，减少脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量，并恢复超氧化物歧化酶（SOD）的活性。JC-1线粒体膜电位检测表明，Exosi-EGR1能有效恢复OGD/R导致的线粒体膜电位下降，减少受损线粒体。 在线粒体自噬方面，研究发现OGD/R处理后，细胞色素c从线粒体释放到细胞质的量增加，而Exosi-EGR1可抑制此过程。TEM观察和LC3-GFP与线粒体共定位分析均显示，Exosi-EGR1处理能进一步增加OGD/R后细胞内的自噬体数量，促进线粒体自噬。蛋白质印迹分析也证实，Exosi-EGR1处理显著提高了线粒体中LC3II/LC3I的比率，并降低了p62蛋白表达，表明线粒体自噬流被增强。 在凋亡方面，TUNEL染色和流式细胞术结果显示，OGD/R导致心肌细胞凋亡率显著升高，而Exosi-EGR1能有效降低凋亡细胞数量。蛋白质印迹结果显示，Exosi-EGR1可上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并下调促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3的表达，从而抑制凋亡通路。
第三阶段：体内动物实验——微针贴片的制备、表征及疗效评估 研究人员选择具有良好生物相容性和生物降解性的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶作为微针的基质材料。通过将GelMA溶液倒入PDMS负模中，经紫外光固化，制备出含有385个锥形阵列的微针贴片。通过浸泡法将hUCMSCs-Exo或hUCMSCs-Exosi-EGR1负载到微针中。荧光显微镜观察证实了外泌体在微针内的均匀分布。力学测试表明，单个微针可承受约0.3牛的力，足以穿透心肌组织。组织粘附力测试显示，贴片对湿润小鼠心室组织的粘附强度达到83千帕，高于小鼠心肌的舒缩力，无需缝合即可牢固粘附。体外药物释放实验证实，该贴片可实现至少15天的持续药物释放。 随后，研究人员在小鼠MI/RI模型上验证了该微针贴片的治疗效果。模型通过开胸结扎左前降支（LAD）冠状动脉30分钟后再灌注建立。实验分为假手术组（Sham）、MI/RI组、MI/RI + hUCMSCs-Exo微针贴片组、MI/RI + Exosi-EGR1微针贴片组。贴片在结扎5分钟后贴敷于缺血区域。 组织学观察发现，微针贴片在植入7天后开始降解，14天完全降解，且心肌组织成功摄取了Dil标记的外泌体。免疫组化结果显示，Exosi-EGR1贴片能显著降低MI/RI引起的EGR1蛋白高表达。Masson染色和天狼星红染色表明，两种贴片均能显著减轻心肌纤维化，但Exosi-EGR1贴片的效果更为显著。H&E染色显示，贴片治疗能减轻炎症浸润和心肌细胞间隙增宽等病理改变。心脏超声检查显示，与MI/RI组相比，两个治疗组在术后第3、7、14、28天的左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）均得到显著改善，其中Exosi-EGR1贴片组的改善效果更优。RT-qPCR检测证实，贴片治疗显著下调了心肌组织中纤维化相关基因MMP-2、TGF-β1和MMP-9的表达。 在作用机制上，体内实验结果与体外实验一致。Exosi-EGR1微针贴片能显著降低心肌组织中氧化损伤标志物8-OHdG的积累，通过TEM观察到促进线粒体自噬体形成，并通过共定位分析证实增强线粒体自噬活性。同时，TUNEL染色和凋亡相关蛋白检测均证实，该贴片能有效抑制心肌细胞凋亡。
研究结论与价值
本研究成功构建了一种负载EGR1 siRNA的hUCMSCs外泌体微针贴片（hUCMSCs-Exosi-EGR1 MN patch）。该治疗策略通过有效沉默EGR1基因，在细胞和动物模型中均显示出强大的心脏保护作用。其作用机制主要是通过减轻氧化应激损伤、保护线粒体功能、促进线粒体自噬以及抑制心肌细胞凋亡，最终显著改善MI/RI后的心脏功能，减轻心肌纤维化。本研究的科学价值在于，它探索并验证了一种将基因治疗、外泌体递送和微针技术相结合的创新性MI/RI治疗策略。其应用价值在于，为心脏疾病的局部、持续、高效治疗提供了新思路，该微针贴片无需缝合即可牢固粘附于心脏表面，简化了手术流程，展现了良好的临床转化潜力。
研究亮点
本研究的亮点主要体现在以下几个方面： 1. 治疗策略的整合创新：将EGR1 siRNA的基因沉默疗法、hUCMSCs外泌体的靶向递送能力以及GelMA微针贴片的局部缓释技术三者有机结合，实现了多维度协同治疗MI/RI。 2. 显着的治疗效果：通过体内外实验系统性地证实，负载了si-EGR1的外泌体在调节氧化应激和促进线粒体自噬方面的效果均优于未负载的hUCMSCs外泌体，明确了基因修饰的增效作用。 3. 递送系统的实用性：所开发的GelMA微针贴片具有足够的机械强度、优异的湿面组织粘附力和可控的长期药物释放性能，解决了传统心肌给药滞留率低、需反复注射的问题，具有较高的临床可操作性。 4. 机制的深入阐释：研究不仅观察到了表型改善，还从活性氧水平、线粒体膜电位、线粒体自噬流、凋亡信号通路等多个层面，深入解析了Exosi-EGR1发挥心脏保护作用的分子机制。