本研究报告了Sun Qingtao、Zhang Jianping、Li Anan、Yao Mei、Liu Guangcai、Chen Siqi、Luo Yue、Wang Zhi、Gong Hui、Li Xiangning及Luo Qingming等作者的研究成果。该研究发表于 *Nature Communications*，文章于2022年发表，DOI为 https://doi.org/10.1038/s41467-022-28493-4。主要完成单位包括华中科技大学武汉光电国家研究中心Britton Chance生物医学光子学中心、海南大学生物医学工程学院以及华中科技大学苏州脑空间信息研究院。
研究背景
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种以记忆丧失和认知障碍为特征的神经退行性疾病。短期记忆障碍是AD的典型表现，在AD小鼠模型中表现为物体识别记忆（object recognition memory, ORM）缺陷。前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）功能障碍与AD患者及AD模型小鼠的ORM损害密切相关。PFC中的端脑外投射（extratelencephalic projection, ET）神经元在短期工作记忆中起关键作用，但ET神经元功能障碍与AD中ORM损害之间的神经环路机制尚不清楚。已有研究表明基底前脑（basal forebrain）支配PFC的胆碱能神经元在AD患者中发生退行性变化，且PFC第V层锥体神经元对乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）具有特异性反应，但过量刺激M1胆碱能受体也可能损害工作记忆。因此，需要进一步明确PFC中ET神经元及其相关环路在ORM调控中的作用。
研究流程与实验设计
该研究采用多种神经科学技术，包括病毒示踪、光遗传学（optogenetics）、化学遗传学（chemogenetics）、全脑成像、光纤光度记录（fiber photometry）以及行为学测试，系统研究了内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）中ET神经元在野生型小鼠和5×FAD小鼠中的功能变化及其与ORM缺陷的关系。
ET神经元活性记录与ORM行为测试
研究者使用Fezf2-CreER小鼠品系靶向标记mPFC中的ET神经元，并通过cre依赖性腺相关病毒（AAV）表达GCaMP6s钙指示剂。5×FAD小鼠与Fezf2-CreER小鼠杂交获得ADFezf2-CreER小鼠。在小鼠5月龄时注射病毒，1个月后进行新物体识别（novel object recognition, NOR）测试并同时进行光纤光度记录。结果显示，物体接触可诱发两组小鼠ET神经元钙信号，但ADFezf2-CreER小鼠的钙信号幅度显著低于Fezf2-CreER小鼠。对照组小鼠仅表达GFP，未观察到与物体接触相关的钙波动。通过c-fos免疫染色进一步验证，NOR测试后Fezf2-CreER小鼠mPFC中c-fos与GCaMP双阳性神经元数量显著高于ADFezf2-CreER小鼠。此外，下游脑区如无名质（substantia innominata, SI）、乳头上核（supramammillary nucleus, SUM）和腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）的c-fos阳性神经元数量在5×FAD实验组中少于野生型实验组。6月龄时，mPFC、SI、SUM和VTA等脑区神经元数量在野生型和5×FAD小鼠间无显著差异，表明上述差异不是由神经元丢失引起。
光遗传学操控mPFC ET神经元胞体
为探究ET神经元功能与ORM的关系，研究者在ADFezf2-CreER小鼠mPFC中表达ChR2，1个月后进行NOR测试，在测试阶段用473 nm激光激活ET神经元胞体。结果显示，光激活显著增加5×FAD小鼠对新物体的探索时间，改善ORM表达，但同时也增加了运动距离。对照组表达GFP的小鼠光刺激后新物体探索时间和运动距离均无显著变化。在Fezf2-CreER小鼠中表达NpHR抑制ET神经元，发现仅在测试阶段抑制ET神经元会破坏ORM表达，而在训练阶段或延迟阶段抑制则无影响。在Fezf2-CreER小鼠中激活ET神经元并不能进一步增强ORM，反而破坏了ORM表达，提示mPFC ET神经元过度兴奋同样损害ORM。激活腹侧海马（ventral hippocampus）不能改善5×FAD小鼠的ORM缺陷。
mPFC ET神经元不同下游投射通路的功能解析
为进一步确定负责ORM表达的特异性神经通路，研究者分别激活mPFC ET神经元在SI、SUM和VTA中的轴突末梢。激活SUM中的轴突末梢显著改善5×FAD小鼠的ORM，而激活VTA中的轴突末梢只增加运动距离但不影响ORM，激活SI中的轴突末梢对ORM和运动均无影响。抑制SUM中的轴突末梢破坏Fezf2-Creer小鼠的ORM，抑制VTA中的轴突末梢降低运动距离但不影响ORM。这表明mPFC中不同投射类型的ET神经元分别调控物体识别和运动。
SUM投射神经元与SI投射神经元的形态学差异
使用霍乱毒素B亚单位（CTB）逆向示踪，发现投射到SUM的神经元主要位于mPFC第Vb层，而投射到SI的神经元主要位于第Va层和第VI层，二者重叠极少。利用CAV-Flex-Flp和FLP依赖性AAV-GFP进行稀疏标记，结合荧光显微光学切片断层成像（fMOST）进行全脑三维重建，发现SUM投射神经元主要投射至下丘脑和中脑，如外侧下丘脑区、背内侧下丘脑核、VTA和黑质网状部，属于锥体束投射（pyramidal tract, PT）神经元；SI投射神经元包括投射至眶额皮层、前扣带皮层、伏隔核和背侧纹状体的端脑内投射（intratelencephalic, IT）神经元，以及投射至边缘丘脑核团的皮层丘脑投射（corticothalamic, CT）神经元。CT和PT神经元的树突长度显著长于IT神经元。
mPFC ET神经元的长程输入筛选
利用狂犬病毒（RV）介导的单突触逆向示踪，在2月龄和6月龄的Fezf2-Creer和ADFezf2-Creer小鼠中筛选mPFC ET神经元的长程输入脑区。结果显示，在两个年龄阶段，大多数输入脑区的输入神经元比例在两组间相似，输入神经元总数及输入神经元/起始细胞比值在相同年龄组间无显著差异，表明mPFC ET神经元的长程兴奋性输入在5×FAD小鼠中未发生广泛的年龄依赖性改变。
胆碱能输入的结构性缺陷
上述RV示踪结合胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫染色显示，6月龄ADFezf2-Creer小鼠的水平斜角带-大细胞核（horizontal diagonal band-magnocellular nucleus, HDB-MA）中，被RV标记的胆碱能神经元数量显著少于Fezf2-Creer小鼠，而在垂直斜角带和SI中无显著差异。ChAT免疫染色显示基底前脑胆碱能神经元总数在两组间无差异，说明6月龄时无胆碱能神经元丢失。顺行示踪显示5×FAD小鼠mPFC中存在大量营养不良的胆碱能轴突，且靠近淀粉样斑块（Aβ plaques）。2月龄5×FAD小鼠mPFC未观察到明显的胆碱能轴突病变，而6月龄出现明显轴突病变，提示胆碱能输入在AD病理过程中逐渐退化。
乙酰胆碱功能缺陷的活体验证
研究者在Fezf2-Creer和ADFezf2-Creer小鼠mPFC的ET神经元中表达乙酰胆碱指示剂ACh2.0，进行NOR测试并同步记录。结果显示，Fezf2-Creer小鼠在物体接触时ET神经元出现明显的乙酰胆碱信号，而ADFezf2-Creer小鼠的乙酰胆碱反应显著降低，表明5×FAD小鼠mPFC ET神经元存在功能性乙酰胆碱输入缺陷。
光遗传学操控胆碱能轴突末梢
在ADChat-Cre小鼠HDB中表达ChR2，并在mPFC中激活胆碱能轴突末梢。结果显示，光激活显著提高5×FAD小鼠对新物体的探索时间，改善ORM，但不影响运动。对照组表达GFP的小鼠光刺激后ORM无改善。在Chat-Cre小鼠中表达NpHR抑制mPFC胆碱能轴突末梢，仅在测试阶段抑制会破坏ORM表达，在训练和延迟阶段抑制无影响。在Chat-Cre小鼠中激活mPFC胆碱能轴突末梢同样破坏ORM表达，提示胆碱能系统需要维持适当活动水平。
乙酰胆碱缺陷改变ET神经元对熟悉物体的反应模式
利用逆向AAV将GCaMP注入SUM以标记投射到SUM的mPFC ET神经元，结合化学遗传学方法激活或抑制HDB胆碱能神经元。结果显示，在正常C57小鼠中，ET神经元对熟悉物体的钙反应显著强于对新物体的反应。而在5×FAD小鼠中，ET神经元对熟悉物体的反应显著降低，对新物体的反应不变，且对熟悉物体的反应强度与物体识别能力呈弱相关。化学遗传学激活HDB胆碱能神经元可恢复5×FAD小鼠ET神经元对熟悉物体的更强反应，同时改善ORM；抑制Chat-Cre小鼠HDB胆碱能神经元则消除了ET神经元对熟悉物体的更强反应并损害ORM。正常条件下，ET神经元对熟悉物体的更强反应与小鼠对新物体的偏好相关；乙酰胆碱缺陷条件下，ET神经元对熟悉物体的更强反应消失，ORM受损。
主要结果与结论
该研究系统揭示了5×FAD小鼠ORM缺陷的神经环路机制。研究发现，5×FAD小鼠mPFC ET神经元在NOR测试中反应降低，且投射至SUM的ET神经元对ORM表达是必需的。激活ET神经元或其在SUM的轴突末梢可挽救5×FAD小鼠的ORM缺陷，抑制则损害ORM表达。5×FAD小鼠mPFC ET神经元接受来自HDB的胆碱能输入发生结构和功能退化。激活mPFC胆碱能纤维可挽救ORM缺陷，而抑制胆碱能纤维则损害ORM表达。在正常小鼠中，mPFC ET神经元对熟悉物体表现出更强反应，对熟悉物体和陌生物体的差异性反应是ORM表达的基础；乙酰胆碱缺乏消除了这种差异性反应，导致ORM受损。研究还发现mPFC ET神经元并不直接编码位置偏好或奖赏信号。
研究意义与价值
该研究首次阐明了mPFC ET神经元及其与HDB胆碱能输入形成的神经环路在AD相关ORM缺陷中的关键作用，为理解AD认知障碍的神经环路机制提供了新的实验依据。同时，研究指出恢复mPFC胆碱能输入或调节ET神经元活动可能是改善AD患者认知障碍的潜在治疗策略。研究还强调了mPFC ET神经元在熟悉物体和陌生物体识别中的区分功能，为理解前额叶皮层在单次物体识别记忆中的作用提供了新视角。
研究亮点
该研究的亮点在于：第一，结合多种前沿技术，包括病毒示踪、全脑成像、光纤光度记录、光遗传学和化学遗传学，从结构连接到功能活动，系统解析了AD小鼠ORM缺陷的神经环路基础；第二，发现mPFC ET神经元对熟悉物体和陌生物体的差异性反应，并证明乙酰胆碱缺乏破坏这种差异性反应是AD小鼠ORM缺陷的重要机制；第三，明确了mPFC-SUM投射通路在ORM表达中的特异性作用，提出了治疗AD认知障碍的潜在干预靶点。