欧洲鼹鼠（Talpa europaea）中发现并部分表征一种高度分化谱系的汉坦病毒

一、 研究团队、发表期刊与时间 本项研究由来自美国夏威夷大学马诺阿分校约翰·A·伯恩斯医学院儿科与热带医学、医学微生物学及药理学科的Se Hun Gu、Mukesh Kumar和Richard Yanagihara，波兰罗兹医科大学分子病理学与神经病理学学科的Beata Sikorska和Paweł P. Liberski，以及波兰罗兹大学生物学与环境保护学院生物多样性研究、教学与生物教育学科的Janusz Hejduk、Janusz Markowski和Marcin Markowski共同合作完成。该研究成果于2016年2月19日发表在Nature旗下的开放获取期刊《Scientific Reports》上，论文编号为6:21119。

二、 学术背景与研究目的 本研究属于病毒学、特别是人畜共患病毒病原学领域，聚焦于汉坦病毒科（Bunyaviridae）汉坦病毒属（Hantavirus）的多样性及其宿主范围演变。 长期以来，啮齿类动物（鼠科和仓鼠科）被认为是汉坦病毒唯一的天然宿主，其中部分病毒可导致人类严重的出血热伴肾综合征（HFRS）或汉坦病毒肺综合征（HPS）。然而，近十年来，研究范式发生转变，越来越多的遗传学证据表明，多种食虫类动物（劳亚食虫目Eulipotyphla，包括鼩鼱和鼹鼠）以及食虫蝙蝠（翼手目Chiroptera）体内也存在与已知病毒差异巨大的汉坦病毒。系统发育分析甚至暗示，食虫类或蝙蝠可能是比啮齿类更原始的汉坦病毒宿主。然而，尽管已发现多达36种非啮齿类携带的“新”汉坦病毒，但其中绝大多数仅以序列形式存在，未能成功分离到病毒体。这种“仅存于序列”的状态，严重阻碍了对其生物学特性、传播动力学，尤其是对人类感染性和致病潜力的认知。

在此背景下，本研究的核心目标是：成功分离并部分表征一种名为“诺瓦病毒”（Nova virus， NVAV）的高度分化鼹鼠源汉坦病毒。NVAV最初于1999年从匈牙利捕获的一只欧洲鼹鼠（Talpa europaea）肝脏组织中检测到，随后在法国和波兰的鼹鼠中亦广泛发现，并被证明是与所有其他汉坦病毒差异最大的谱系之一。成功分离NVAV被视为获取其生物学知识、研究其传播动力学、并最终评估其对人类健康风险的关键里程碑。

三、 详细研究流程 本研究遵循了从现场样本采集到实验室病毒分离、鉴定、表征，再到动物感染模型评价的完整流程。

1. 样本采集与初步筛查：

   • 研究对象与地点：研究团队于2013年6月21日至8月26日期间，在波兰中部Huta Dłutowska地区捕获了22只活的欧洲鼹鼠。所有野外操作、安乐死及组织处理流程均获得了波兰罗兹当地伦理委员会和环境主管部门的批准。
   • 处理与筛查：对捕获的鼹鼠实施安乐死后，采集其肺组织。从每个肺组织中提取总RNA，逆转录为cDNA后，使用NVAV特异性的引物进行RT-PCR检测。结果显示，22只鼹鼠中有11只（50%）的肺组织呈NVAV RNA阳性。根据PCR条带强度，选取其中4只鼹鼠的肺组织制备匀浆，用于后续的病毒分离尝试。

2. 病毒分离与体外培养：

   • 细胞系与接种：使用Vero E6细胞系进行病毒分离。将1%（重量/体积）的鼹鼠肺组织匀浆接种到长满单层的Vero E6细胞中。
   • 病毒检测与传代：接种后定期（每2-5周）收集细胞和培养上清，通过RT-PCR检测NVAV RNA。初期在接种后第17天检测到病毒RNA，但在传代过程中丢失。经过数次失败后，最终成功在一份样本（编号TE34）中，于接种后第34天在细胞和培养上清中稳定检测到病毒RNA。将含有病毒的上清接种到新的Vero E6细胞中，证实了病毒的复制能力。
   • 病毒滴度与形态观察：培养至120天时，测定病毒培养上清的感染滴度为8×10³噬斑形成单位（PFU）/毫升。与大多数已分离的汉坦病毒类似，NVAV在Vero E6细胞中不产生明显的细胞病变效应（CPE）。通过薄切片透射电子显微镜观察感染细胞，发现了典型的汉坦病毒样颗粒，直径约80-120纳米。

3. 病毒基因组测序与生物信息学分析：

   • 病毒株命名：将成功分离的病毒株命名为NVAV strain TE34。
   • 全基因组扩增与测序：设计了覆盖全基因组的特异性引物，采用RT-PCR、巢式PCR及RACE技术，分别从NVAV TE34分离株（细胞培养物）以及原始鼹鼠肺组织（编号TE34的个体）中扩增并测定了其小（S）、中（M）、大（L）三个基因片段的完整序列。
   • 序列分析：分析基因组结构、开放阅读框、编码蛋白的氨基酸序列。将TE34株的序列与已知的NVAV原型株（匈牙利株MSB95703）以及其他代表性的啮齿类、鼩鼱类、鼹鼠类和蝙蝠源汉坦病毒的序列进行比较，计算核苷酸和氨基酸序列相似性。
   • 系统发育分析：基于S、M、L片段全长编码序列，采用最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树，使用GTR+I+Γ进化模型。分析旨在确定NVAV在汉坦病毒进化树中的位置及其与其他病毒谱系的亲缘关系。

4. 实验动物感染研究：

   • 动物与伦理：使用新生瑞士韦伯斯特小鼠，感染实验获得了夏威夷大学机构动物护理与使用委员会的批准。
   • 感染方案：通过腹腔注射途径，给2日龄小鼠接种200 PFU的NVAV TE34分离株。
   • 临床观察与评分：每日监测小鼠体重变化和神经症状，使用标准化量表（1-5分）评估疾病严重程度，评分标准涵盖毛发粗糙、活动亢进、瘫痪到濒死状态。
   • 样本采集与检测：对濒死小鼠实施安乐死。收集血清，使用间接免疫荧光法（IFA）检测抗NVAV抗体。采集肺、肝、肾、脾和脑组织，用于：a) 病毒载量定量：通过TaqMan实时定量RT-PCR检测各组织中NVAV RNA拷贝数；b) 病理学检查：组织切片经苏木精-伊红（H&E）染色，观察病理变化；c) 免疫组织化学染色：使用针对神经元核抗原（NeuN，标记神经元）、小胶质细胞钙结合蛋白（Iba1，标记活化小胶质细胞）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP，标记星形胶质细胞）的抗体进行染色，以评估脑组织的神经病理变化。
   • 病毒再分离：将感染致死小鼠的脑组织匀浆接种给新的新生小鼠，观察疾病表现并验证病毒序列的一致性。

四、 主要研究结果 1. 成功分离与初步表征：研究首次成功从欧洲鼹鼠肺组织中分离出NVAV，并能在Vero E6细胞中稳定传代。电镜观察证实了典型的汉坦病毒颗粒形态。从细胞培养物中获得的TE34分离株与原始肺组织中的病毒S片段序列完全一致，排除了细胞培养过程中发生显著突变的可能性。

1. 基因组的高度独特性：

   • TE34株的S、M、L片段长度分别为1825、3590和6563个核苷酸，编码核衣壳蛋白（N，428个氨基酸）、糖蛋白前体（Gn/Gc，1127个氨基酸）和RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp，2157个氨基酸）。
   • 序列差异巨大：与代表性的啮齿类、鼩鼱类和大多数鼹鼠类汉坦病毒相比，NVAV TE34株在N蛋白和Gn/Gc糖蛋白的氨基酸序列相似性上普遍低于50%，在RdRp上的相似性也低于60%。特别是其糖蛋白Gn上存在一个独特的N-连接糖基化位点（N101），这在所有已知汉坦病毒中未见报道。如此低的相似性预示，NVAV与其他汉坦病毒之间可能不存在抗体交叉中和反应。
   • 保守结构域：尽管序列差异大，但病毒蛋白的关键功能域（如M片段上的WAASA基序、L片段上的RdRp保守基序Premotif A、A、B、C、D、E，包括催化必需的XDD基序）均保守存在。

2. 系统发育位置：基于三个片段全长序列构建的系统发育树均显示出高度一致的拓扑结构，并获得高支持率（后验概率）。NVAV的所有已知毒株（来自波兰、匈牙利、法国）形成一个独立且高度分化的进化支。重要的是，该支系在进化树上与一系列蝙蝠源汉坦病毒（如Laibin virus, Longquan virus等）的关系最为接近，提示它们可能拥有共同的古老进化起源，而非近期从啮齿类宿主“跳跃”而来。

3. 实验感染的致病性：

   • 临床表现：所有接种NVAV的新生小鼠均在感染后第16天开始出现体重下降和活动亢进。其中11只小鼠疾病进展，出现后肢瘫痪，并在随后4天内死亡或达到濒死状态而被安乐死。
   • 病毒分布：定量RT-PCR显示，濒死小鼠的肺、肝、肾、脾和脑组织中均能检测到高拷贝的NVAV RNA，其中脑组织的病毒载量比其他组织高出10-100倍。
   • 神经病理学特征：组织病理学检查发现，病变主要集中在脑部。包括：小脑等处出现血管周围和软脑膜下淋巴细胞浸润；大脑皮层存在局灶性神经元丢失（NeuN染色证实）；广泛的小胶质细胞激活（Iba1染色强阳性）和星形胶质细胞增生（GFAP染色强阳性）。这些变化共同表明NVAV引起了严重的病毒性脑膜脑炎。
   • 疾病可传递性：用感染致死小鼠的脑组织匀浆接种新生小鼠，可复制出与原始分离株感染相同的致死性脑炎症状，且分离出的病毒序列与原始株一致，证明了疾病的病原体可传递性。
   • 肺部病变：肺部可见血管周围淋巴细胞浸润和肺泡间隔轻度增宽，但未出现典型的肺综合征特征如透明膜形成或肺泡内水肿。

五、 结论与意义 本研究成功完成了首次对鼹鼠源汉坦病毒——诺瓦病毒（NVAV）的分离与部分表征，这是该研究领域一个重要的里程碑。主要结论与价值如下： 1. 证实了高度分化谱系的存在：通过获得病毒分离株和全基因组数据，确凿证明了NVAV是一个在遗传学上高度独特、与已知汉坦病毒差异巨大的独立谱系，其与蝙蝠源病毒的亲缘关系为理解汉坦病毒的深层进化历史提供了新线索。 2. 提供了可操作的生物材料：NVAV TE34株的获得，为后续深入研究该病毒的生物学特性（如受体利用、复制周期、免疫逃逸等）、传播动力学（如是否存在气溶胶、接触或垂直传播），以及开发针对性的诊断试剂（如血清学检测、PCR引物/探针优化）提供了不可或缺的实验材料。 3. 揭示了潜在的神经侵袭性：在新生小鼠模型中，NVAV表现出强烈的神经嗜性，导致致命的脑膜脑炎。尽管这与已知的人类汉坦病毒病（HFRS/HPS）主要临床表现（肾或肺损伤）不同，且尚不清楚其与人类疾病的相关性，但该模型本身为研究汉坦病毒的神经致病机制提供了一个有价值的工具。 4. 提出了公共卫生警示与研究方向：鉴于欧洲鼹鼠分布广泛且常栖居在人类居住区附近，NVAV在其种群中感染率高（本研究中达50%），本研究提醒临床医生和公共卫生人员，对可能与鼹鼠有接触史并出现发热或非典型神经系统症状的患者，应警惕潜在的NVAV感染。分离株将助力开发更可靠的诊断方法，用于在人群中筛查NVAV感染，从而评估其真实的人类致病潜力。 5. 为比较病原学研究搭建平台：拥有NVAV分离株，使得未来可以将其与已知致病的啮齿类汉坦病毒、以及已分离的其他非啮齿类汉坦病毒（如Thottapalayam virus, Imjin virus）进行全面的比较研究，包括在更接近人类的动物模型（如叙利亚仓鼠）中评估其致病性，从而更深入地理解决定汉坦病毒宿主范围、组织嗜性和致病性的分子基础。

六、 研究亮点 1. 突破性分离成功：克服了从食虫类动物组织中分离汉坦病毒的长期技术困难，首次获得了鼹鼠源汉坦病毒的活病毒分离株，填补了该领域的关键空白。 2. 高度分化的新谱系：明确了NVAV是汉坦病毒属中一个极其独特的进化分支，其基因组，尤其是糖蛋白序列的高度差异，预示了其抗原性和生物学特性的新颖性。 3. 连接蝙蝠与食虫类病毒的进化桥梁：系统发育分析首次以完整的病毒分离株基因组数据，强有力地支持了NVAV与蝙蝠源汉坦病毒的密切关系，为描绘汉坦病毒在劳亚食虫目与翼手目宿主间的复杂进化史提供了坚实证据。 4. 建立了神经侵袭性动物模型：成功构建了NVAV感染新生小鼠的致死性脑炎模型，详细描绘了其临床进程、病毒分布特征和神经病理变化，为研究该病毒的致病机制提供了可用的体内系统。

七、 其他有价值的内容 论文还讨论了本研究的局限性及未来展望：例如，小鼠模型的表现可能不直接反映人类疾病；未来需要使用更相关的动物模型（如叙利亚仓鼠）来评估NVAV引起类似HFRS/HPS疾病的能力；需要开展血清流行病学调查以寻找人类感染的证据；以及利用该分离株研究病毒进入、复制和组装等基础生物学过程。文章末尾详细列出了研究所用的所有特异性引物序列，为其他研究者进行相关研究提供了宝贵的技术资源。