这是一项由瑞典乌普萨拉大学（Uppsala University）药学系的 Inga Petersen、Greta Hultqvist 及其同事主导的原创研究，发表于 *Scientific Reports*，2024 年第 14 卷，文章编号 30613，DOI 为 10.1038/s41598-024-83627-6。该研究的核心目的是优化一种靶向转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）的双特异性抗体的血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）穿越效率，通过改变连接肽长度来减少受体交联，从而提高药物入脑能力。研究对象为基于先前发表的抗体 rmAb158-scFv8D3 所构建的一系列连接肽长度不同的变体。

在学术背景方面，血脑屏障是限制大分子药物尤其是抗体进入脑组织的主要障碍。研究表明，静脉注射后进入脑间质的抗体比例通常不足注射剂量的 0.05–0.1%。利用转铁蛋白受体介导的转胞吞作用（transcytosis）是一种被广泛研究的主动递送策略。TfR 在血脑屏障内皮细胞的顶侧高表达，负责铁的转运。然而，抗体与 TfR 的双价结合被认为会引发受体交联（crosslinking），导致内吞后抗体积聚或降解，从而降低转胞吞效率，尤其是在高浓度给药时。此前已有研究指出，单价结合或降低亲和力可能有助于高剂量下的脑摄取。该研究试图回答的科学问题是：对于对称型双特异性抗体 rmAb158-scFv8D3，缩短连接肽长度是否可以在保留双价结合能力的同时降低受体交联，从而在低浓度和高浓度下都实现高效的血脑屏障穿越。

研究流程主要包含四个步骤。第一步是设计和表达抗体变体。研究人员在原有 11 个氨基酸（amino acid, aa）连接肽的基础上，构建了连接肽长度分别为 -2 aa、1 aa、2 aa、3 aa、8 aa、12 aa、38 aa 和 80 aa 的八种 rmAb158-scFv8D3 变体。其中 -2 aa 连接肽表示去除了 scFv8D3 的 N 端两个氨基酸并直接与轻链 C 端融合。研究中还设置了两类对照抗体：8D3（鼠 IgG2c 同种型）作为双价 TfR 结合对照；scFv8D3-scFc 作为单价 TfR 结合对照。所有蛋白采用 Expi293 细胞瞬时转染表达，经蛋白 G 亲和层析纯化。SDS-PAGE 和尺寸排阻色谱（SEC）分析显示纯度均高于 95%。接下来是结构稳定性表征。通过纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）测定抗体在升温过程中 350 nm/330 nm 荧光比值的变化。结果显示，连接肽长度在 1 aa 至 80 aa 范围内的变体均表现出约 67 ℃ 和 79 ℃ 两个解折叠转变温度，而 -2 aa 连接肽变体在约 60 ℃ 出现额外的解折叠事件，提示该变体的热稳定性下降。此外，ELISA 确认连接肽长度的变化未降低抗体的 Aβ 原纤维亲和力。

第二步是研究抗体与鼠源转铁蛋白受体胞外域（mTfRpro119）的结合特征。首先，纯化的 mTfRpro119 在非还原条件下 SDS-PAGE 显示条带接近 100 kDa，质谱光散射分析（mass photometry）表明其在 PBS 中处于单体-二聚体平衡。使用间接 ELISA 对高密度包被的 mTfRpro119 进行结合检测。结果发现，在促进双价结合的高包被浓度下，随着连接肽长度增加，结合强度呈现轻微上升趋势；8D3 结合最强，scFv8D3-scFc 结合最弱。随后，采用 LigandTracer 实时相互作用分析系统对 -2 aa、1 aa、3 aa、11 aa 和 38 aa 连接肽变体进行动力学测定。实验中采用 I-125 放射性标记抗体，在解离阶段加入等摩尔未标记抗体以竞争性抑制重新结合。数据使用“一对一耗竭校正”模型进行拟合。结果显示，所有 rmAb158-scFv8D3 变体的解离速率常数（kd）均处于相似数量级，且显著低于单价对照 scFv8D3-scFc；同时，随着连接肽缩短，kd 呈下降趋势。例如，-2 aa、1 aa 和 3 aa 连接肽变体的 kd 分别约为 0.35 nM、0.34 nM 和 0.38 nM，而 38 aa 变体为 0.49 nM，8D3 为 0.95 nM（表 1）。结合动力学和 ELISA 数据，作者判断所有变体仍可进行双价结合，但短连接肽可能降低了跨越不同 TfR 分子间双价结合的概率。

第三步是体外血脑屏障转胞吞实验。采用 in-cell BBB-trans 模型，将小鼠脑内皮细胞（cEND 细胞）培养在多孔插入式培养板中形成单层。分别在 13.3 nM 和 266 nM 两个浓度下处理 1 小时，洗涤后继续孵育 6 小时，收集基底侧培养基并用 ELISA 定量抗体浓度。低浓度下，所有变体及 8D3 的转胞吞水平相近，均显著高于单价对照 scFv8D3-scFc（图 5b）。高浓度下，-2 aa 和 1 aa 连接肽变体的基底侧抗体浓度约是低浓度处理时的两倍以上，而长连接肽变体和 8D3 仅略有增加（图 5c）。高浓度下，短连接肽变体的转胞吞水平与单价对照相当。该结果提示，在 TfR 饱和条件下，短连接肽变体虽然具有双价结合能力，但其实际行为更接近单价结合剂，从而避免受体交联带来的转胞吞抑制。

综合上述结果，研究得出以下结论。短连接肽变体仍表现出与长连接肽变体相似的表观亲和力，表明连接肽长度并未改变抗体的双价结合基本属性，但改变了其与不同 TfR 分子间形成交联结构的概率。在生理相关的高浓度条件下，-2 aa 和 1 aa 连接肽变体达到了与单价对照相当的转胞吞水平，而长连接肽变体和 8D3 则明显较低。在此基础上，作者提出一个核心假设：双价结合本身并不必然降低体外血脑屏障转胞吞，但 TfR 靶向结构域之间的物理距离非常短时，抗体更倾向于结合单个 TfR 二聚体内部的亚基，从而显著降低受体交联的概率，因此获得类似单价结合剂的转胞吞特征。此外，在低浓度下，短连接肽变体仍与双价对照 8D3 一样高效，优于单价对照。这一特性意味着短连接肽变体可能在低剂量下即可达到与单价制剂相当的脑内暴露水平，从而有利于降低不良反应风险。相较已获 FDA 批准的 lecanemab（rmAb158 的人源化版本），这些短连接肽变体通过主动脑递送机制，有潜力实现更强疗效与更低剂量的目标。

本研究的主要亮点体现在三个方面。第一，通过系统性地缩短连接肽至极限长度（包括 -2 aa），证明双价抗体仍可保留双价结合能力，但能有效降低 TfR 交联，拓宽了双特异性 BBB 穿梭抗体的设计空间。第二，结合间接 ELISA、LigandTracer 动力学分析及体外 BBB 转胞吞模型，建立了从结构表征到功能验证的递进式实验流程。特别是 LigandTracer 采用竞争性未标记抗体进行解离阶段测量，更准确地揭示了短连接肽变体的动力学特征。第三，提出了“双价结合但低交联”的设计理念，为后续开发用于阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的抗体治疗药物提供了可行的对称型抗体骨架。需要注意的是，该研究尚未进行体内实验验证，血脑屏障穿越效率和血液半衰期仍需在动物模型中进一步证实。