本文是由Konstantin Barylyuk、Ludek Koreny、Huiling Ke等研究人员完成的，主要作者隶属于剑桥大学Department of Biochemistry、Milner Therapeutics Institute等单位，以及来自英国牛津大学、沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学和日本北海道大学的研究机构。这篇研究发表于Cell Host & Microbe期刊，发布日期为2020年11月11日。文章题目为“A Comprehensive Subcellular Atlas of the Toxoplasma Proteome via HyperLOPIT Provides Spatial Context for Protein Functions”，展示了一项重要的细胞空间蛋白质组学（spatial proteomics）研究。
学术背景
Toxoplasma gondii（弓形虫）是一种广泛分布的单细胞寄生虫，属于顶复体生物门（Apicomplexa）。该寄生虫可引起妊娠毒浆体病等疾病，对人类和牲畜健康产生重大威胁。顶复体寄生虫细胞具有高度特化的亚细胞结构，例如顶体复合体（apical complex），用于宿主细胞入侵。其蛋白质组也表现出极大的新颖性，几乎有一半蛋白质未被表征（hypothetical proteins）。
尽管对T. gondii蛋白质的研究已进行多年，使用免疫荧光显微镜等技术确定蛋白的亚细胞定位，但目前仍缺乏全面描述其蛋白质分布和寄主适应性的分子机制。因此，这项研究的目的是通过一种高分辨率的空间蛋白质组学方法——HyperLOPIT技术（Hyperplexed Localization of Organelle Proteins by Isotope Tagging），系统解析T. gondii的亚细胞蛋白质组结构。
这项研究采用了详细而复杂的实验流程，分为以下几个主要步骤：
1. 全细胞生化分级与裂解实验设计
研究对象为T. gondii的胞外速殖子（extracellular tachyzoites），这是该寄生虫准备入侵宿主细胞的生活史阶段。通过优化的细胞裂解方法（例如氮气喷裂技术）来破坏细胞完整性，并使用线性密度梯度离心结合分级收集细胞器组分。
2. HyperLOPIT技术与质谱分析
HyperLOPIT技术利用10重标记串联体质量标记（TMT10plex isobaric tags）来标记肽段，随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定样本中蛋白质在不同亚细胞分级组分中的丰度分布。这种技术能够广泛同时检测4000余种蛋白质的分布。
3. 数据维度缩减与机器学习分析
利用t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）对复杂数据进行降维，将蛋白质位置信息投影到二维数据空间。此外，研究中使用了Tagm-MAP贝叶斯分类模型，根据标记蛋白的分布训练出高精度亚细胞蛋白质分布分类器。
4. 实验验证
通过基因内源性标签方法（epitope tagging）对80种蛋白进行免疫荧光显微镜实验（IFA）验证。其中62种蛋白成功验证了HyperLOPIT预测的准确性。
1. 弓形虫亚细胞蛋白质组的全面地图
研究总共定量并识别了3832种蛋白，其中2634种蛋白被分配到了26个独特的亚细胞空间区域，分辨率涵盖细胞器膜、细胞骨架、分泌性蛋白复合物等，包括线粒体、顶体复合体、内膜复合体（IMC）。
2. 特殊细胞器的结构信息
HyperLOPIT能分辨细胞器内部的亚结构。例如，研究明确区分了线粒体和顶体的膜蛋白与可溶性组分。而顶体这种细胞入侵结构被进一步划分为含膜蛋白和可溶性内容物的两个簇。
3. 新发现的未表征蛋白
研究首次赋予795个假设蛋白（hypothetical proteins）的具体亚细胞定位，并为这些蛋白提供了潜在生物功能的线索，例如宿主侵入相关的微线粒体蛋白和密集颗粒（dense granules）蛋白。
4. RNA表达调控与亚细胞相关性
通过整合转录组学数据，结果显示一些大型蛋白质复合体（如核糖体、蛋白酶体）中蛋白基因的表达存在强相关性，表明其受严格的转录调控。相比之下，线粒体可溶性蛋白的转录水平与其亚细胞分布并不总是相关。
这项研究以高分辨率和高精度的方式首次绘制了T. gondii的亚细胞蛋白质分布图谱，为解释寄生虫的功能及其适应性进化提供了广泛的分子基础。此研究的意义包括：
科学价值
该研究提出了顶复体寄生虫的亚细胞功能与蛋白质进化之间的新观点，并揭示了新颖的生物过程，例如线粒体相关蛋白可能的转运适应性。
应用前景
鉴定出的多种宿主相互作用相关蛋白，尤其是特化的分泌性蛋白，为开发抗T. gondii药物或疫苗提供了重要线索。此外，HyperLOPIT为空间蛋白质研究提供了新的技术标准，适用于其他复杂真核生物领域。
创新性
HyperLOPIT方法创新性地整合了空间蛋白组学实验与机器学习分析框架，实现了前所未有的细胞器分辨率。
发现新区域
研究揭示了弓形虫的诸多新蛋白质簇，特别是在顶体复合体、线粒体、内膜复合体等特殊结构中。
进化分析
通过探讨祖先蛋白的演化路径，研究解析了顶复体寄生虫从自由生活祖先到寄生生活的关键分子事件。
这项研究为寄生虫分子细胞生物学开辟了新的理解维度。它不仅提供了对T. gondii细胞复杂性的深入理解，还揭示了顶复体寄生虫细胞系统演化及其复杂功能调控的根本机制。在科学与治疗研究上，此研究将为了解其他相关病原体如疟原虫提供重要的比较平台，同时推动顶复体类病原体精准诊断工具与目标治疗方法的发展。