由Garry R. Buettner、Thomas P. Doherty以及Larry K. Patterson*共同完成的研究论文《The kinetics of the reaction of superoxide radical with Fe(III) complexes of EDTA, DETAPAC and HEDTA》，于1983年7月发表在期刊FEBS Letters的第158卷第1期上。Garry R. Buettner和Thomas P. Doherty来自美国印第安纳州克劳福兹维尔的沃巴什学院化学系，而Larry K. Patterson则来自印第安纳州圣母大学的辐射实验室。这项研究旨在深入理解超氧自由基在生物体系中产生羟基自由基的机制，并探究不同铁螯合剂如何影响这一过程，具有重要的生物化学和自由基生物学意义。
本研究的学术背景根植于自由基生物学和生物无机化学领域。超氧阴离子自由基在所有需氧生物中都会产生，其本身反应活性有限，但已知在过氧化氢和铁离子的存在下，可以通过“铁催化的哈伯-韦斯反应”生成高反应活性的羟基自由基，后者对生物分子具有极强的破坏力。然而，不同的铁螯合剂对这一催化过程的影响存在显著差异。例如，金属螯合剂二亚乙基三胺五乙酸（DTPA或DETAPAC）能够抑制超氧化物生成体系中的羟基自由基产生，而结构类似的乙二胺四乙酸（EDTA）和N-羟乙基乙二胺三乙酸（HEDTA）则不能。这种抑制作用的机制尚不明确：可能是由于DETAPAC减慢了超氧化物还原Fe(III)的速率（即哈伯-韦斯反应的第一步），也可能是其抑制了芬顿反应（第二步）。先前有研究暗示DETAPAC并不阻断芬顿反应，但可能减缓第一步还原反应。为了明确区分这两种作用模式，本研究选择了EDTA、HEDTA和DETAPAC这三种结构相关的螯合剂，系统比较了它们与Fe(III)形成的配合物与超氧化物反应的动力学，并评估了其Fe(II)形式催化芬顿反应产生羟基自由基的能力。
研究的工作流程主要包含两个核心且相互关联的实验部分：脉冲辐解动力学研究和电子自旋共振（ESR）自旋捕获实验。
第一部分是脉冲辐解动力学研究，旨在精确测定超氧阴离子自由基与三种Fe(III)螯合物反应的二级速率常数。实验在圣母大学辐射实验室的线性加速器上进行，使用脉宽约5纳秒的8兆电子伏特电子脉冲进行辐照。研究体系采用了标准化的脉冲辐解技术。实验对象是含有0.1 mM Fe(III)螯合物（Fe(III)EDTA, Fe(III)HEDTA, Fe(III)DETAPAC）、20 mM甲酸钠和5 mM磷酸盐缓冲液的溶液。甲酸盐的作用是在辐解过程中，通过捕获初级辐解产物（如水合电子、氢原子），将其高效转化为超氧阴离子自由基，因为甲酸根是羟基自由基的良好清除剂，反应生成二氧化碳阴离子自由基，后者能迅速被氧气氧化为超氧化物。溶液在辐照前用氧气饱和，以确保超氧化物的生成环境。超氧阴离子的浓度通过其在250纳米附近的特征吸收进行监测，而Fe(III)的还原过程则在280-300纳米波段进行跟踪。数据分析采用拟一级动力学分析方法。本研究采用(CNS)₂⁻离子进行剂量测定，这是一种标准的化学剂量计，用于校准每个脉冲产生的自由基数量，从而确保动力学数据的准确性。这一部分研究的关键在于其高时间分辨率，能够直接观测并定量毫秒至微秒级的快速自由基反应。
第二部分是电子自旋共振自旋捕获实验，旨在验证不同Fe(II)螯合物催化芬顿反应产生羟基自由基的能力。实验使用Varian E-4谱仪进行。研究流程如下：首先配制含有50 mM自旋捕获剂DMPO（5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）和80 μM过氧化氢的溶液，并用氮气吹扫以去除氧气。然后，向该溶液中快速注入最终浓度为20 μM的Fe(II)螯合物（Fe(II)EDTA, Fe(II)HEDTA, Fe(II)DETAPAC）等分试样。DMPO能够与短寿命的羟基自由基反应，生成相对稳定的、具有特征ESR信号的DMPO/•OH加合物。通过比较不同Fe(II)螯合物存在下产生的DMPO/•OH加合物ESR信号的强度，可以半定量地评估各螯合物催化芬顿反应的效率。作为对照，在不存在Fe(II)螯合物的情况下不产生ESR信号。这部分实验的关键技术在于自旋捕获剂DMPO的纯化和使用，它能够将瞬态自由基“固定”下来，从而用常规ESR谱仪进行检测和鉴定。
研究取得了明确而重要的结果。在脉冲辐解动力学研究中，获得了三种Fe(III)螯合物在pH 6.0、7.0和8.0条件下与超氧化物反应的二级速率常数。数据显示，Fe(III)EDTA和Fe(III)HEDTA与超氧化物的反应非常迅速。在pH 7.0时，Fe(III)EDTA的速率常数为1.9 x 10⁶ M⁻¹ s⁻¹，Fe(III)HEDTA为7.6 x 10⁵ M⁻¹ s⁻¹，这与文献报道值相符。值得注意的是，反应速率具有pH依赖性，随着pH升高而降低。例如，Fe(III)EDTA在pH 6.0时为3.1 x 10⁶ M⁻¹ s⁻¹，到pH 8.0时降至5.0 x 10⁵ M⁻¹ s⁻¹。在pH 8.0时，Fe(III)HEDTA体系还观察到了类似Fe(III)EDTA在更高pH下报告的复合物形成现象。与此形成鲜明对比的是，在相同的pH范围（6.0-8.0）内，未能检测到超氧化物与Fe(III)DETAPAC发生任何明显的反应。事实上，在Fe(III)DETAPAC存在下，超氧化物的表观寿命反而有所增加。作者认为，这可能是过量的DETAPAC螯合了由缓冲盐和甲酸盐引入的微量金属杂质，从而抑制了这些杂质对超氧化物的催化歧化作用。基于实验的检测极限，他们得出结论：Fe(III)DETAPAC与超氧化物反应的速率常数上限小于1 x 10⁴ M⁻¹ s⁻¹，这比另外两种螯合物慢了至少两个数量级。这一结果直接回答了研究的一个核心问题：DETAPAC抑制羟基自由基生成的机制之一是极大地减缓了超氧化物还原Fe(III)的步骤。
在ESR自旋捕获实验中，结果清楚地表明，所有三种Fe(II)螯合物都能催化芬顿反应产生羟基自由基，因为都观察到了特征性的DMPO/•OH加合物ESR信号（其超精细分裂常数为aN = aH = 15.0 G）。然而，信号强度因螯合物不同而有显著差异。在保持所有其他条件恒定的情况下，使用Fe(II)DETAPAC时获得的ESR信号最强。Fe(II)HEDTA产生的信号强度约为Fe(II)DETAPAC的40%，而Fe(II)EDTA产生的信号强度最弱，仅为Fe(II)DETAPAC的8%。这一结果至关重要，因为它排除了DETAPAC通过抑制芬顿反应本身来阻止羟基自由基产生的可能性。相反，实验证明Fe(II)DETAPAC实际上是所测试的三种螯合物中催化芬顿反应效率最高的一个。这一发现与动力学结果相结合，构成了完整的逻辑链条。
基于上述结果，研究者进行了深入的讨论并得出了明确的结论。他们首先探讨了反应速率的pH依赖性，认为这可能与配合物的水解程度和/或净电荷有关。Fe(III)DETAPAC在pH 6-8范围内以非水解形式存在，净电荷为-2；Fe(III)HEDTA主要以净电荷为-1的非水解形式存在；而Fe(III)EDTA则是净电荷为-1的非水解形式和净电荷为-2的水解形式的混合物。因此，配合物的整体电荷可能在动力学中起作用。热力学计算表明，在pH 7时，Fe(III)DETAPAC的还原电位（+357 mV）与超氧化物还原氧气的电位（-330 mV）耦合，其反应驱动力甚至大于Fe(III)EDTA（+113 mV）和Fe(III)HEDTA（+372 mV）。这说明观察到的反应速率差异并非由热力学因素主导，而更可能源于空间位阻等动力学因素。DETAPAC配体具有更多的配位原子和更大的空间结构，可能阻碍了超氧化物接近铁中心。
本研究的主要结论是：DETAPAC抑制“铁催化的哈伯-韦斯反应”并阻止羟基自由基产生的机制，在于它极大地减慢了超氧化物还原Fe(III)的步骤，而不是抑制随后的芬顿反应。事实上，Fe(II)DETAPAC是所研究体系中催化芬顿反应最有效的催化剂。这一结论具有重要的方法论意义。它从动力学角度证实了，在许多生物化学和生物学研究中，使用DETAPAC作为探针来检验“铁催化的哈伯-韦斯反应”是否参与某一过程是合理的，因为它的抑制作用具有特异性（阻断还原步骤）。同时，作者也提出了一个重要的实践建议：如果为了探测此类化学反应而向体系中引入铁复合物，最好引入Fe(III)形式而非Fe(II)形式，因为Fe(II)会立即引发芬顿反应产生羟基自由基，这可能干扰或误导实验结果，而这一点在当时的研究中并未被普遍注意。
本研究的亮点在于：首先，它通过精密的脉冲辐解动力学实验，首次直接、定量地证明了Fe(III)DETAPAC与超氧化物的反应速率极慢（<10⁴ M⁻¹ s⁻¹），远低于Fe(III)EDTA和Fe(III)HEDTA，为DETAPAC的抑制机制提供了关键的动力学证据。其次，它巧妙地结合了脉冲辐解（研究反应1）和自旋捕获（研究反应2）两种互补的技术，完整地揭示了整个催化循环中哪一步被抑制，得出了明确且令人信服的结论。第三，研究发现了Fe(II)DETAPAC催化芬顿反应的效率反而更高这一反直觉的现象，强调了不能仅凭最终效应（抑制•OH产生）来推断中间步骤的机制。最后，研究不仅具有基础科学价值，澄清了一个重要的自由基反应机制问题，还为后续生物医学研究中正确使用金属螯合剂（特别是DETAPAC）作为工具或潜在的保护剂提供了直接的理论指导和实验依据。