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研究概况 本研究由天津医科大学病理生理学系的张华璐（Hualu Zhang）、杨宁志（Ningzhi Yang）、何海燕（Haiyan He）以及天津市第一中心医院心脏外科的柴军武（Junwu Chai）等人作为共同第一作者，由徐哲龙（Zhelong Xu）、孔祥荣（Xiangrong Kong）和杨清（Qing Yang）作为通讯作者共同完成。该研究于2021年9月28日在线发表在国际心脏病学期刊《Basic Research in Cardiology》（基础心脏病学研究）上。

研究背景 本研究聚焦于心肌再灌注损伤的分子机制，特别是线粒体自噬（mitophagy）在其中扮演的角色。在急性心肌梗死的治疗中，尽早恢复缺血心肌的血液灌注是挽救心肌的必要手段，但这一过程本身会诱发额外的损伤，即心肌再灌注损伤（myocardial reperfusion injury）。目前普遍认为，再灌注时心肌细胞线粒体产生的过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）是导致再灌注损伤的关键因素。受损的线粒体会产生更多ROS，形成一个氧化应激的恶性循环。为此，细胞通过一种名为线粒体自噬的选择性自噬机制，特异性地清除这些功能失调的线粒体，这被认为是一种内源性的心肌保护措施。然而，在再灌注阶段，线粒体自噬究竟处于何种状态，其精确的调控机制又是什么，在学术界仍是一个悬而未决的问题。 研究团队将目光聚焦于锌离子（Zn²⁺）及其转运蛋白。已有研究表明，锌离子可以诱导线粒体自噬，而线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）是调控线粒体自噬的关键因素。锌离子转运蛋白ZIP7（由SLC39A7基因编码）主要负责将锌离子从细胞器（如内质网和高尔基体）释放到细胞质中，调控胞内锌离子稳态。最新研究发现ZIP7也存在于线粒体上。基于此，研究人员提出了一个核心假设：ZIP7通过调节线粒体内的锌离子水平来影响线粒体膜电位，进而调控线粒体自噬，并最终参与心肌再灌注损伤的发生。

研究工作流程与详细方法 为验证上述假设，研究团队设计并执行了一套从体外细胞实验到在体动物实验，再到人体组织验证的多层次、系统性的研究方案。

第一步：在生理条件下验证ZIP7对线粒体自噬的调控作用。 研究首先在非应激的正常条件下，观察ZIP7表达水平改变对线粒体自噬的影响。研究对象包括H9c2大鼠心肌细胞系、C57BL/6小鼠和通过CRISPR/Cas9技术构建的心脏特异性ZIP7条件性敲除小鼠（ZIP7 cKO）。在H9c2细胞上，利用CRISPR/Cas9技术敲除ZIP7基因（ZIP7 KO）或使用小干扰RNA（siRNA）敲低其表达。在小鼠体内，则利用ZIP7 cKO小鼠和ZIP7过表达小鼠模型。 研究人员通过检测线粒体外膜蛋白TOM20、TOM22和线粒体基质酶柠檬酸合酶（citrate synthase）等线粒体标志物的表达水平，以及自噬标志物LC3-II的蛋白水平来评估线粒体自噬活性。结果显示，在H9c2细胞中，ZIP7 KO和siRNA敲低均显著降低了TOM20和柠檬酸合酶水平，增加了LC3-II水平，表明ZIP7的缺失激活了线粒体自噬。在小鼠心脏中，ZIP7 cKO同样增强了线粒体自噬，表现为TOM20、TOM22和柠檬酸合酶表达下降，LC3-II表达上升。相反，过表达ZIP7则抑制了线粒体自噬。该部分研究明确证实，ZIP7是生理状态下线粒体自噬的负向调控因子。

第二步：探究再灌注条件下ZIP7的表达变化及其对线粒体自噬的影响。 研究者首先检测了缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤过程中ZIP7的表达动态。通过分离成年小鼠心肌细胞进行缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）实验，利用离体大鼠心脏Langendorff灌流模型和在体小鼠心脏I/R模型，研究人员发现ZIP7的表达在单纯缺血期并未发生明显变化，但在再灌注开始后的10分钟内即出现迅速且显著的上调，其信使RNA（mRNA）水平也同步升高。 接下来，为验证这种上调对线粒体自噬的影响，研究团队采用了多种先进手段进行检测。在体内实验中，使用了对pH敏感的线粒体荧光探针MitoQC和Mito-Keima。MitoQC在正常环境下呈绿色和红色双色荧光，而当线粒体被递送至溶酶体进行降解时，绿色荧光被酸性环境淬灭，仅保留红色荧光，从而实现对线粒体自噬的精准可视化。结果显示，在野生型小鼠心脏中，再灌注早期线粒体自噬并未被激活，而ZIP7 cKO小鼠心脏在再灌注后，线粒体自噬活性显著增强。流式细胞术和共聚焦显微镜对Mito-Keima的分析也一致表明，ZIP7缺陷促进了再灌注时的线粒体自噬。为进一步确认该发现，研究者采用氯喹（chloroquine）来阻断自噬流，发现ZIP7 cKO小鼠心脏线粒体中LC3-II的积累更多，说明ZIP7缺失是通过增强自噬流来促进线粒体自噬，而非阻断其降解过程。

第三步：解析ZIP7调控线粒体自噬的分子通路与机制。 这部分旨在阐明ZIP7抑制线粒体自噬的具体机制。研究的焦点是经典的PINK1/Parkin通路。通过分离线粒体进行蛋白印迹分析，并结合共聚焦显微镜观察，研究人员发现，无论是在H9c2细胞还是小鼠心肌细胞中，ZIP7的基因敲除均能显著增加PINK1和Parkin蛋白在线粒体上的积累。这一结果在ZIP7 cKO小鼠心脏的分离线粒体中也得到了验证。这表明ZIP7通过阻止PINK1和Parkin向线粒体募集来抑制线粒体自噬。 那么，ZIP7是如何阻止PINK1/Parkin这条通路的呢？根据PINK1在线粒体膜电位下降时才能稳定于线粒体外膜的经典理论，研究者将目光转向了线粒体膜电位。研究发现，ZIP7确实定位于心脏线粒体上。ZIP7 cKO小鼠心脏线粒体内的锌离子浓度显著升高，而再灌注导致的线粒体锌离子丢失被有效缓解。使用锌离子螯合剂TPEN降低线粒体锌离子水平后，线粒体膜电位发生了超极化。反之，ZIP7 cKO通过增加线粒体内锌离子的蓄积，导致了线粒体膜电位的去极化（下降），这恰好为PINK1的稳定和累积创造了条件。这部分研究完整地揭示了“ZIP7表达上调 → 线粒体锌离子外流增加 → 锌离子减少 → 膜电位超极化/难以去极化 → PINK1无法稳定 → Parkin无法被募集 → 线粒体自噬被抑制”这一逻辑严密的信号传导机制。 值得一提的是，研究团队还收集了因缺血性心脏病导致心力衰竭（heart failure，HF）的接受心脏移植患者的左心室和左心房组织，以及来自健康捐献者的心房组织作为对照。结果显示，心力衰竭患者心脏线粒体中ZIP7的表达显著上调，而PINK1和LC3-II的水平则显著下降，这与在小鼠模型中观察到的现象完全一致。这一临床样本数据的验证极大地增强了研究结论的转化医学价值。

第四步：验证增强的线粒体自噬对心肌再灌注损伤的功能性影响。 最后一部分探究了ZIP7调控的线粒体自噬对心肌损伤的直接功能学意义。研究人员首先评估了ROS的产生。采用二氢乙啶（DHE）染色和一种可在线粒体基质中特异性检测过氧化氢（H₂O₂）的质谱探针MitoB。结果显示，再灌注后小鼠心脏ROS和线粒体H₂O₂水平急剧升高，而ZIP7 cKO能显著抑制这种氧化应激。这证明了ZIP7缺失促发的线粒体自噬有效清除了受损线粒体，从而切断了ROS的过量产生源头。最后，研究人员通过TTC染色法测量了心肌梗死面积，这是评价心肌损伤的金标准。结果显示，ZIP7 cKO小鼠和注射了ZIP7 siRNA的小鼠，其心肌梗死面积均显著小于对照组；而ZIP7过表达则加重了梗死。为了进一步确证PINK1/Parkin通路的核心地位，研究人员在ZIP7 cKO小鼠体内注射PINK1 siRNA敲低PINK1表达，结果ZIP7 cKO的心肌保护效应被完全消除。

研究结论与价值 本研究首次揭示了锌离子转运蛋白ZIP7在心肌再灌注损伤中的关键致病作用和全新调控机制。其科学价值在于：明确了再灌注损伤时内源性线粒体自噬功能是被抑制的，ZIP7在再灌注早期的快速上调是导致这种抑制的关键原因，且PINK1/Parkin通路是ZIP7发挥作用的下游核心机制。其潜在的应用价值在于：将线粒体ZIP7确定为心肌再灌注损伤的一个全新治疗靶点，提示在再灌注早期及时抑制心脏ZIP7的上调或使其失活，是减轻心肌损伤、保护心脏功能的重要策略。这一发现不仅为治疗心肌梗死提供了新思路，也可能为其他因氧化应激和线粒体功能障碍导致的心脏疾病提供治疗方向。

研究亮点 本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，它是一个发现性研究，首次将锌离子转运蛋白ZIP7与心肌再灌注损伤中的线粒体自噬抑制现象直接联系起来，填补了该领域的知识空白。第二，研究手段全面且前沿，巧妙结合了CRISPR/Cas9基因编辑构建的细胞和条件性敲除动物模型，并运用了Mito-Keima、MitoQC和MitoB等多种先进的分子探针技术，在细胞、离体组织和在体动物水平上，对线粒体自噬活性和线粒体内特定分子的变化进行了多维度、高精度的动态监测。第三，研究从基础机制出发，无缝衔接到临床验证，利用心力衰竭患者的心脏组织样本证实了在小鼠模型中的核心发现，极大地提升了研究成果的临床相关性和转化潜力，为将ZIP7作为药物靶点的开发奠定了坚实的基础。