本研究由徐瀚卿（Hanqing Xu）、陈升（Sheng Chen）、孟成（Cheng Meng）、何毅（Yi He）、黄小建（Xiao-jian Huang）* 和尤洪波（Hong-bo You）* 主导，来自华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科。该研究成果于2024年发表在期刊 Molecular Medicine 上。

一、 学术背景

本研究聚焦于骨关节炎（Osteoarthritis， OA）这一全球范围内，尤其是老年人群中高发的退行性关节疾病。其主要病理特征包括关节软骨破坏、软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜增生。目前，OA的发病机制尚未完全阐明，但软骨损伤和炎症反应被公认为关键驱动因素。其中，炎症因子如白细胞介素-1β（IL-1β）在OA患者的滑膜、软骨及滑液中水平升高，能够刺激软骨细胞产生诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）以及基质金属蛋白酶（MMPs）等，加剧软骨细胞损伤和细胞外基质（如II型胶原和聚集蛋白聚糖 Aggrecan）的降解。

趋化因子及其受体在炎症和免疫反应中扮演核心角色，是治疗免疫炎性疾病（如类风湿关节炎）的潜在靶点。CC趋化因子受体1（CC Chemokine Receptor 1， CCR1）是趋化因子受体家族的重要成员。先前研究已表明，在类风湿关节炎中阻断CCR1可以抑制滑膜中的巨噬细胞浸润。然而，CCR1在软骨细胞中的表达及其在OA发生发展中的作用尚不明确，存在争议。BX471是一种高选择性、小分子的CCR1拮抗剂。

因此，本研究旨在：（1）探究CCR1在软骨细胞中的表达情况；（2）分析抑制CCR1（使用BX471）对小鼠软骨细胞炎症反应、合成代谢及衰老的影响；（3）揭示其潜在的分子机制；（4）评估在体小鼠OA模型（内侧半月板失稳模型，Destabilization of the Medial Meniscus， DMM）中抑制CCR1对关节软骨的保护作用。本研究的意义在于探索CCR1作为OA治疗新靶点的可能性。

二、 详细工作流程

本研究系统性地结合了体外细胞实验和体内动物模型实验。

1. 细胞实验部分（体外）

研究首先从5日龄C57BL/6J小鼠的膝关节骨骺软骨中分离并培养原代软骨细胞，使用第2-3代细胞进行后续实验。

• 细胞活力检测：为确保BX471的细胞安全性，研究使用CCK-8试剂盒评估了不同浓度BX471（2.5, 5, 10 μM）在有无IL-1β刺激（10 ng/ml，持续24小时）条件下对软骨细胞活力的影响。结果显示，这些浓度的BX471不影响细胞活力，因此后续实验选用5 μM和10 μM浓度。
• CCR1表达验证：通过Western Blot和实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，研究人员首先确认了在正常及IL-1β诱导的炎症环境下软骨细胞中CCR1及其主要配体（CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7）的表达。发现IL-1β刺激能显著上调CCR1及其多个配体的表达，证实炎症刺激能激活软骨细胞的CCR1通路。
• 探究CCR1抑制的功能效应：
  • 衰老指标：使用Western Blot检测衰老标志物P16INK4a和P21CIP1蛋白水平，并使用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒评估细胞衰老活性。实验组包括对照组、IL-1β刺激组以及IL-1β+BX471共处理组。
  • 合成与分解代谢指标：Western Blot和RT-qPCR检测关键合成代谢指标（聚集蛋白聚糖Aggrecan和转录因子SOX9）以及分解代谢/炎症指标（COX-2, iNOS, MMP13）的表达。同时，利用Western Blot、RT-qPCR和免疫荧光染色检测细胞外基质主要成分II型胶原（Collagen II）的表达。
  • 机制通路探索：
    • MAPK通路：通过Western Blot检测MAPK信号通路关键蛋白（p38, ERK, JNK）及其磷酸化（激活）水平，以探究BX471是否通过影响该通路起作用。
    • PPAR-γ通路：通过Western Blot和免疫荧光染色检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的表达。为了验证PPAR-γ在BX471作用中的必要性，研究使用了PPAR-γ的特异性抑制剂GW9662。实验设置对照组、IL-1β刺激组、IL-1β+BX471组以及IL-1β+BX471+GW9662组，然后再次检测Aggrecan、Collagen II、MMP13、COX-2和iNOS的蛋白水平，观察GW9662是否逆转了BX471的保护作用。

2. 动物实验部分（体内）

研究人员构建了小鼠OA模型——内侧半月板失稳手术模型。将32只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：假手术组（Sham）、OA模型组（DMM）、DMM+低剂量BX471组（1.5 mg/kg）和DMM+高剂量BX471组（3 mg/kg）。

• 模型建立与干预：对DMM组及BX471治疗组小鼠进行右膝DMM手术以诱发OA。假手术组仅打开关节囊后缝合。术后第7天开始，对治疗组小鼠进行关节腔内注射相应浓度的BX471（每周一次，共5次），假手术组和DMM模型组则注射等量生理盐水。
• 评估与检测：
  • Micro-CT扫描：实验结束后，获取小鼠右侧膝关节进行Micro-CT扫描，以评估骨骼结构的改变。
  • 组织学与免疫组织化学评估：膝关节标本经固定、脱钙、石蜡包埋后切片，进行苏木精-伊红（H&E）染色和番红O/固绿染色，依据国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分系统对软骨损伤进行定量评分。同时，对切片进行免疫组织化学染色，检测CCR1、II型胶原和MMP13在软骨组织中的表达与分布。

3. 数据分析

所有实验均独立重复至少三次，数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。正态分布数据采用单因素方差分析，非参数数据（如OARSI评分）采用Kruskal-Wallis H检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。

三、 主要研究结果

1. 炎症条件下软骨细胞中CCR1表达上调。 Western Blot和RT-qPCR结果显示，IL-1β刺激能显著增加小鼠原代软骨细胞中CCR1蛋白和mRNA的表达，并上调其主要配体CCL3-CCL7的mRNA水平。在DMM小鼠模型的软骨组织中，CCR1阳性的软骨细胞数量也显著多于假手术组。这证实了在体外炎症环境和体内OA病理状态下，软骨细胞的CCR1通路被激活。

2. BX471抑制CCR1可减轻IL-1β诱导的软骨细胞衰老。 与对照组相比，IL-1β处理显著增加了衰老标志蛋白P16INK4a和P21CIP1的表达，并提高了SA-β-gal染色阳性率。而BX471处理能有效逆转这些变化，将相关指标降低至接近基线水平，表明抑制CCR1可以缓解软骨细胞的炎症性衰老。

3. BX471可拮抗IL-1β对软骨细胞合成代谢的破坏，并抑制分解代谢和炎症反应。 在分子水平上，IL-1β导致合成代谢关键因子Aggrecan和SOX9的蛋白表达急剧下降，而分解代谢/炎症因子MMP13、iNOS和COX-2的表达则大幅上调。BX471共处理能够显著恢复Aggrecan和SOX9的表达水平，同时抑制MMP13、iNOS和COX-2的过度表达。免疫荧光和Western Blot结果一致显示，BX471能够保护软骨细胞特有的II型胶原免于IL-1β诱导的降解。

4. BX471可下调IL-1β诱导的CCR1自身表达。 有趣的是，IL-1β刺激会上调CCR1的表达，而使用BX471处理后，这种上调被抑制，即BX471形成了一个负反馈调节环路，降低了炎症环境下CCR1的丰度。

5. MAPK和PPAR-γ通路介导了BX471的保护作用。 * MAPK通路：IL-1β刺激显著激活了MAPK通路，表现为p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平升高。BX471处理能有效抑制这种磷酸化激活。 * PPAR-γ通路：IL-1β显著抑制了具有抗炎和保护作用的PPAR-γ的表达，而BX471则恢复了其表达水平。关键验证实验显示，当使用PPAR-γ抑制剂GW9662后，BX471对软骨细胞的保护作用（即恢复合成代谢、抑制分解和炎症因子）被显著削弱。这直接证明了PPAR-γ的激活是BX471发挥保护效应的必要环节。

6. 体内实验证实BX471可延缓OA进展。 在DMM小鼠模型中，关节腔内注射BX471显著改善了关节软骨的破坏情况。组织学染色（H&E和番红O/固绿）显示，BX471治疗组的软骨结构更完整，蛋白聚糖丢失更少，OARSI评分显著低于DMM模型组。免疫组化结果也显示，治疗组的软骨组织中II型胶原的阳性染色更多，而MMP13的阳性细胞数更少。这些结果与体外实验结论相互印证，表明抑制CCR1在活体水平也能有效延缓OA的病理进程。

四、 研究结论

本研究系统性地证明：CCR1在小鼠软骨细胞中表达，并在OA相关的炎症微环境下（IL-1β刺激或DMM手术诱导）表达上调。使用小分子抑制剂BX471抑制CCR1，能够有效减轻软骨细胞的炎症反应、缓解细胞衰老、促进合成代谢并抑制分解代谢。这种保护作用的分子机制涉及抑制MAPK信号通路的激活，以及激活PPAR-γ通路。最终，体内实验证实，关节内注射BX471能显著减轻DMM模型小鼠的软骨破坏和OA进展。

五、 研究价值与意义

科学价值：本研究首次深入阐明了CCR1在软骨细胞中的功能及其在OA病理过程中的作用机制。它将CCR1这一在免疫炎性疾病中备受关注的受体与OA的核心病理环节（炎症、衰老、代谢失衡）联系起来，并揭示了其通过MAPK和PPAR-γ两条关键通路发挥作用，为理解OA的分子病理网络提供了新的视角。

应用价值：研究结果表明，靶向CCR1是治疗OA的一个极具潜力的新策略。BX471作为高选择性CCR1拮抗剂，在细胞和动物模型中均显示出良好的保护效果，这为开发新型OA治疗药物（如关节腔注射制剂）提供了重要的临床前证据和候选分子。

六、 研究亮点

1. 靶点新颖性：首次系统地将CCR1确立为OA治疗的新潜在靶点，拓展了趋化因子受体在退行性关节病领域的研究边界。
2. 机制深度：研究不仅观察了现象（抑制CCR1可保护软骨），还深入探讨了其背后的分子机制，明确了MAPK和PPAR-γ两条关键通路在其中的介导作用，特别是通过使用抑制剂GW9662证实了PPAR-γ的必要性，机制阐述清晰完整。
3. 研究体系完备：从体外细胞实验（验证表达、探究功能、挖掘机制）到体内动物模型（验证治疗效果），构建了完整的研究证据链，结论更具说服力。
4. 功能验证全面：评估了CCR1抑制对软骨细胞多方面的关键影响，包括衰老（P16/P21， SA-β-gal）、炎症（iNOS， COX-2）、合成代谢（Aggrecan， SOX9， Collagen II）和分解代谢（MMP13），涵盖了OA软骨退变的多个核心环节。

七、 其他说明

研究者也指出了本研究的局限性：研究主要在小鼠细胞和模型中进行，需在成人软骨细胞乃至临床样本中进一步验证；DMM手术模型不能完全模拟自然发生的OA病程。未来的研究方向包括使用CCR1基因敲除小鼠进行研究，以及获取正常人和OA患者的软骨样本进行验证，以促进研究成果向临床转化。