Amor等人于2020年7月在《Nature》期刊上发表了一项开创性研究，首次提出了利用靶向衰老细胞的嵌合抗原受体T细胞（senolytic CAR T cells）作为治疗衰老相关疾病的新策略。该研究由纪念斯隆凯特琳癌症中心的Corina Amor、Judith Feucht、Josef Leibold以及Michel Sadelain和Scott W. Lowe共同领衔完成。
这项研究的学术背景根植于细胞衰老（cellular senescence）领域。细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态，同时伴随着一种能够调节组织微环境的分泌程序，即衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）。在生理情况下，衰老作为一种肿瘤抑制机制，阻止癌前细胞的扩增，并在伤口愈合中发挥有益作用。然而，在病理状态下，衰老细胞的异常积累会产生一个炎症环境，导致慢性组织损伤，并促成肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎等多种疾病。因此，从受损组织中清除衰老细胞在小鼠模型中已被证实能改善这些病理症状，甚至延长寿命。基于此，开发能够选择性清除衰老细胞的“衰老细胞清除剂”（senolytics）引起了越来越多的关注。当时已有一些显示此类活性的小分子药物，但大多数缺乏效力且会产生严重的副作用。因此，该研究团队旨在探索一种替代方法，即利用基因改造的T细胞，通过嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）技术，精准靶向并消灭衰老细胞。
研究的详细工作流程分为几个关键阶段。第一阶段是靶点鉴定。为了找到一个在衰老细胞表面广泛且特异性上调的蛋白作为CAR T细胞的攻击靶点，研究者对比了三种独立且稳健的衰老模型的RNA测序（rna-seq）数据：由MEK和CDK4/6抑制剂联合诱导的疗法诱导型衰老小鼠肺腺癌细胞；通过水动力尾静脉注射（hydrodynamic tail vein injection, HTVI）在体内递送NrasG12V癌基因诱导的肝细胞衰老（ois）；以及培养诱导的小鼠肝星状细胞衰老。研究聚焦于在三个数据集中均上调的、编码定位于质膜的转录本，最终确定了8个候选基因。这些基因编码的蛋白大多与细胞外基质重塑或凝血级联反应相关。理想的CAR T细胞靶点应在靶细胞高表达而在重要生命组织中低表达。因此，他们根据上调幅度和人类蛋白图谱中的组织表达谱对这些候选基因进行排序和筛选，最终确定了PLAUR基因，其编码尿激酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase plasminogen activator receptor, uPAR），作为最合适的候选靶点。uPAR是尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）的受体，在纤维蛋白溶解、伤口愈合或肿瘤发生过程中，uPA能促进细胞外基质降解。此外，uPAR的一部分被蛋白水解切割后产生可溶性uPAR（supar），它是SASP的一部分，并可作为肾脏疾病和糖尿病的血清生物标志物。
第二阶段是靶点验证。研究者在体外和体内模型中验证了uPAR在衰老细胞表面的诱导情况。在体外，他们评估了由药物诱导衰老的KP肺癌细胞和复制性衰老的人类原代黑色素细胞，发现两种模型中细胞表面uPAR表达和supar水平均显著升高。在体内，他们检测了接受MEK和CDK4/6抑制剂联合治疗的非小细胞肺癌患者来源的异种移植模型（PDX）、通过HTVI过表达NrasG12V诱导的肝细胞衰老模型、由内源性KrasG12D表达驱动的小鼠胰腺上皮内瘤变（panin）衰老模型，以及由四氯化碳（ccl4）诱导的、衰老肝星状细胞参与其病理生理过程的肝纤维化小鼠模型。在所有这些系统中，诱导衰老的处理都增加了uPAR阳性细胞的数量和血清supar水平。值得注意的是，uPAR阳性细胞不表达增殖标志物Ki67，但与经典的SASP成分IL-6共表达。最后，研究者还证实了在患有衰老相关疾病（如不同病因的肝纤维化、动脉粥样硬化斑块和panin）的患者组织中uPAR也呈现高表达，且与衰老标志物p16和IL-6共定位。
第三阶段是CAR T细胞的构建与体外功能验证。研究团队构建了一种靶向鼠源uPAR的嵌合抗原受体（m.uPAR-h.28z），其包含抗小鼠uPAR的单链可变片段（scFv），以及人CD28共刺激域和CD3ζ信号域。他们将此CAR转导到人T细胞中，并进行细胞毒性实验。结果显示，m.uPAR-h.28z CAR T细胞对uPAR阴性的NALM6（一种人CD19+前B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系）细胞无杀伤作用，但对人为表达uPAR的NALM6细胞具有与靶向CD19的经典CAR T细胞（h.19-h.28z）相当的杀伤活性。至关重要的是，m.uPAR-h.28z CAR T细胞能高效清除内源性表达uPAR的衰老KP细胞，并伴随抗原特异性的颗粒酶B（granzyme B）和干扰素γ（IFNγ）分泌。这表明该CAR T细胞能够选择性且高效地靶向衰老细胞。
第四阶段是体内疗效验证。研究者在多个动物模型中评估了senolytic CAR T细胞的治疗潜力。首先，在使用NrasG12V诱导的免疫缺陷小鼠肝细胞衰老模型中，m.uPAR-h.28z CAR T细胞治疗在10天内导致生物发光信号的显著下降，组织学分析证实治疗后肝脏中衰老肝细胞数量急剧减少，且CAR T细胞在衰老肝细胞周围聚集并显示出效应记忆表型。其次，在免疫功能健全的背景下，研究者将完全鼠源化的CAR（m.uPAR-m.28z）转导至小鼠T细胞，并将其用于治疗携带原位KP肺腺癌的小鼠。他们采用了一种“衰老诱导-清除”的联合治疗策略，先使用MEK和CDK4/6抑制剂诱导肿瘤细胞衰老，然后再输注uPAR靶向的CAR T细胞。结果显示，该联合疗法显著延长了小鼠的生存期，并减少了肺部的衰老肿瘤细胞，同时伴随激活的CD4+和CD8+ T细胞的浸润增加。
研究的亮点集中体现在其对肝纤维化这一典型衰老相关疾病的卓越疗效上。在CCl4诱导的肝纤维化模型中，无论给予低剂量（0.5–1×106）还是高剂量（2–3×106）的m.uPAR-m.28z CAR T细胞，均取得了显著的抗纤维化效果。治疗20天后，与对照组相比，CAR T细胞治疗组小鼠肝脏中的衰老细胞和纤维化程度（通过天狼星红染色评估）均显著减少，血清supar水平和肝损伤标志物谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）也均降低，表明其清除了促炎的衰老肝星状细胞并减轻了肝损伤。利用生物发光成像追踪T细胞发现，uPAR靶向的CAR T细胞选择性地在纤维化肝脏中聚集、扩增，随后迅速收缩。此外，研究还将应用拓展到由非酒精性脂肪性肝炎（NASH）诱导的肝纤维化模型中，发现NASH模型中也存在衰老细胞，并且在使用低剂量的uPAR CAR T细胞治疗后，衰老细胞被有效清除，纤维化减少，肝功能得到改善，且未引起可检测的毒性。
在安全性方面，研究发现疗效与剂量密切相关。在有效治疗剂量下，小鼠未出现明显的发病率、体温或体重变化。然而，在超治疗剂量下，小鼠出现了低温和体重下降，伴随血清中IL-6、GM-CSF、G-CSF和IFNγ等细胞因子的升高，呈现出与CAR T细胞相关的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）相似的特征。这种早期毒性是暂时的，可以通过降低CAR T细胞剂量或联合使用IL-6R和IL-1R抑制剂来预防和缓解，且这些CRS预防措施不会削弱CAR T细胞的治疗效果。
这项研究的核心结论是，uPAR作为一种在衰老细胞表面广泛诱导的蛋白，可以作为一个有效的治疗靶点。针对uPAR的CAR T细胞能够在体外和体内有效清除衰老细胞，并在肺癌和肝纤维化等多种小鼠模型中展现出显著的治疗效果，验证了senolytic CAR T细胞在衰老相关疾病中的治疗潜力。此外，supar作为衰老细胞分泌的可溶性形式，其血清水平可用作监测CAR T细胞体内衰老细胞清除活性的生物标志物。
该研究的科学价值与应用价值重大。它首次从概念上验证了CAR T细胞作为一种有效“衰老细胞清除剂”的可行性，为治疗由衰老驱动的慢性疾病开辟了全新的免疫治疗路径。研究指出，与肿瘤细胞不同，衰老细胞不分裂，也不创造免疫抑制微环境，这可能是发展治疗性CAR T细胞时面临的障碍较小的原因。此外，研究中使用的基于CD28/CD3ζ的第二代CAR T细胞在发挥治疗作用后迅速减少，这一特性在减少对正常组织稳态中衰老有益方面的长期干扰上可能具有吸引力，同时还便于在日后需要时进行再次给药。该研究不仅限于肝纤维化，还指出这种方法可能对动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等与衰老相关的广泛疾病具有治疗潜力，为未来开发针对不同特定衰老背景的senolytic CAR T细胞疗法奠定了坚实基础，并为将小分子药物无法解决的靶点变为可用CAR T细胞攻击的靶点提供了范例。