本研究由Mengru Zhu、Junhao Xia、Jia Liu、Wei Zou、Xin Guan、Lizhi Wang、Yichen Wang、Bing Wang、Fengya Wang、Qingwen Zhang、Keman He、Lukuan Liu与Jing Liu共同完成，通讯作者为Lukuan Liu和Jing Liu。作者团队主要来自大连医科大学附属第一医院干细胞临床研究中心、辽宁省干细胞与精准医学前沿技术重点实验室、大连干细胞与精准医学创新研究院、大连医科大学附属第一医院整形外科及放射肿瘤科。该研究于2025年10月8日在线发表于材料与生物医学交叉领域的期刊《Materials Today Bio》（第35卷，文章ID：102377）。
一、 学术背景 本研究聚焦于放射治疗（Radiation Therapy）中一个常见且棘手的临床并发症：辐射诱导性皮肤损伤（Radiation-Induced Skin Injury, RSI）。高达95%接受放疗的患者会出现不同程度的RSI，其急性期表现为放射性皮炎，特征是红斑、脱屑甚至溃疡，若处理不当，可能发展为永久性的毛细血管扩张和纤维化等晚期副作用。目前临床管理缺乏统一标准，主要依赖现代敷料和外用皮质类固醇等对症治疗，疗效有限且伴有副作用。因此，开发针对RSI病理核心的新型治疗策略迫在眉睫。
近年来研究揭示，线粒体是电离辐射的主要胞内靶点，RSI的核心病理特征包括持续的线粒体功能障碍和DNA修复机制受损。辐射可直接破坏线粒体膜完整性，导致活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）过量积累，进而引发DNA损伤、能量代谢紊乱和细胞凋亡。同时，线粒体质量控制（Mitochondrial Quality Control, MQC）机制，如线粒体自噬（Mitophagy），在维持线粒体稳态和抑制凋亡中起关键作用。因此，修复或调控线粒体功能被视为缓解RSI的有效策略。
虽然以人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, hUMSCs）为代表的干细胞疗法在促进组织再生方面展现出潜力，但其临床应用面临细胞安全性、传代限制等问题。大量证据表明，hUMSCs的益处很大程度上通过旁分泌机制，尤其是细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）介导。然而，天然EVs存在产量低、大小和内容物异质性高、生物发生过程不可控等局限，阻碍了其标准化和大规模临床应用。为了克服这些挑战，细胞膜衍生的纳米囊泡（Nanovesicles, NVs）作为EV模拟物被开发出来。NVs可通过机械挤压或超声等方法快速、大量制备，其组成、可重复性和功能递送更具可控性。
基于此，本研究团队提出并验证了一项创新性治疗策略：利用源自hUMSCs、富含线粒体蛋白的纳米囊泡（Mitochondria-Enriched NVs, ME-NVs）来治疗RSI。研究旨在探究ME-NVs是否能够通过递送生物活性线粒体成分，同时靶向修复DNA损伤和恢复线粒体质量控制，从而为RSI提供一种无细胞、可规模化的新型纳米治疗方法。
二、 详细工作流程 本研究是一项综合性的实验研究，涵盖了纳米囊泡的制备与表征、体外细胞模型验证、体内动物模型治疗评估以及基于蛋白质组学的机制探索。其工作流程逻辑严密，层层递进。
第一部分：ME-NVs的制备、表征与蛋白质组学分析 首先，研究人员从符合伦理规范获取的人脐带中分离培养hUMSCs。通过将hUMSCs悬浮液依次挤压通过孔径递减（10 μm, 5 μm, 1 μm）的聚碳酸酯膜，利用剪切力使细胞膜碎片化并自组装，成功制备出hUMSCs来源的NVs。作为对照，也通过超速离心法从hUMSCs条件培养基中分离了天然的小细胞外囊泡（sEVs）。 * 表征方法：使用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定NVs的粒径分布和浓度；透射电子显微镜（TEM）观察形态；测量Zeta电位评估表面电荷；蛋白质印迹法（Western Blot）检测经典的EVs标记蛋白（如CD9, CD63, HSP70）；BCA法测定蛋白质产量。 * 关键发现与衔接：制备的NVs平均直径约为183 nm，呈杯状，Zeta电位为负值（约-31.93 mV），并表达sEVs标志蛋白，表明成功制备了具有典型囊泡特征的NVs。更重要的是，NVs的蛋白产量是sEVs的15.2倍，凸显了其高产优势。这为后续大规模功能实验提供了物质基础。 * 蛋白质组学分析：为进一步探究NVs的功能基础，研究团队对NVs进行了无标记蛋白质组学分析（采用数据依赖采集模式，DDA）。通过与MitoCarta 3.0线粒体蛋白质数据库对比，发现NVs中含有638种线粒体相关蛋白，占该数据库参考集的56.31%，证实其高度“富集”线粒体成分。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，这些蛋白显著富集于氧化磷酸化、ATP合成、线粒体电子传递、线粒体分裂/融合调控以及细胞凋亡信号通路等。这从分子层面揭示了ME-NVs具备调控线粒体能量代谢、动力学和质量控制的潜力，为后续解释其治疗机制提供了直接证据。
第二部分：体外细胞模型建立与剂量效应研究 为模拟RSI并确定后续实验条件，研究选用人永生化角质形成细胞（HaCaT，代表表皮）和人皮肤成纤维细胞（HSF，代表真皮）建立体外辐射损伤模型。 * 实验流程：对两种细胞施以不同剂量的X射线照射（HaCaT: 4, 8, 12 Gy；HSF: 8, 12, 16 Gy）。照射后，通过CCK-8法检测细胞活力；Annexin V/PI染色结合流式细胞术检测细胞凋亡；DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平；TMRE荧光染料检测线粒体膜电位（ΔΨm）；使用MitoTracker和LysoTracker共染色，通过共聚焦显微镜观察并计算皮尔逊相关系数，定量评估线粒体-溶酶体共定位（反映线粒体自噬水平）；使用ImageJ的线粒体分析插件对线粒体形态（如长宽比、面积、周长）进行定量分析。 * 关键结果与衔接：结果表明，辐射以剂量依赖的方式降低细胞活力、增加凋亡和ROS水平、降低ΔΨm，并增强线粒体-溶酶体共定位（即激活线粒体自噬）。线粒体形态分析显示辐射导致线粒体碎片化。对比发现，HaCaT细胞在8 Gy时损伤已较明显，而HSF细胞在16 Gy时损伤更为严重。据此，研究选择8 Gy作为HaCaT细胞、16 Gy作为HSF细胞的后续实验辐射剂量。这部分工作不仅验证了辐射在细胞水平成功诱导了线粒体功能障碍和细胞损伤，也为后续NVs的疗效评估提供了明确的损伤基线。
第三部分：NVs的细胞摄取及其体外保护效应验证 在确定辐射剂量后，研究评估了NVs的治疗潜力。 * 细胞摄取：用PKH26红色荧光染料标记NVs，与HaCaT和HSF细胞共孵育2小时后，通过共聚焦显微镜观察证实NVs能被两种细胞高效内化。 * 疗效评估：细胞在辐射前2小时用NVs（10 μg/ml）预处理。随后检测发现，NVs处理能显著恢复辐射后细胞活力，促进划痕愈合（细胞迁移），降低ROS水平，并减少细胞凋亡。Western Blot分析进一步显示，NVs处理下调了辐射引起的促凋亡蛋白Bax的表达、上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并降低了p53及其下游靶点p21的蛋白水平，提示NVs可能通过调控p53通路抑制辐射诱导的细胞凋亡和周期阻滞。 * 机制初探——聚焦线粒体：研究深入探究了NVs对线粒体功能和质量控制的影响。结果显示，NVs处理能有效恢复辐射降低的ΔΨm。共聚焦和超分辨率显微镜观察结合形态学定量分析表明，NVs能逆转辐射导致的线粒体碎片化，促进线粒体网络向更长、更管状的形态恢复（即抑制过度分裂，促进融合）。同时，NVs处理显著降低了辐射后升高的线粒体-溶酶体共定位水平。Western Blot分析发现，辐射显著上调了线粒体自噬关键蛋白PINK1和Parkin的表达，而NVs处理抑制了这种上调。此外，NVs还下调了线粒体分裂蛋白Drp1的表达，上调了融合蛋白Mfn1和Mfn2的表达。这些结果表明，NVs通过抑制PINK1/Parkin介导的过度线粒体自噬，并平衡Drp1与Mfn1/2调控的线粒体分裂与融合动力学，从而恢复线粒体稳态。
第四部分：体内动物模型疗效与安全性评估 为验证NVs在活体中的治疗效果，研究建立了SD大鼠急性RSI模型。 * 模型建立与给药：大鼠背部皮肤接受单次35 Gy的X射线照射。在辐射后第9天（伤口完全形成时）开始治疗，通过多点皮内注射的方式，每3天给予一次NVs（累计剂量50 μg/只），对照组注射等量生理盐水。在第28天处死动物采集皮肤样本进行分析。 * 疗效评估：宏观观察显示，NVs治疗组大鼠的皮肤伤口愈合加速，损伤评分显著低于对照组。苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色显示，NVs治疗减少了表皮增厚和炎症浸润，促进了毛囊再生和胶原纤维的有序沉积。免疫荧光染色（CD31和α-SMA）表明，NVs治疗恢复了辐射损伤区域的血管生成。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示NVs减少了组织中的凋亡细胞。γ-H2AX免疫组化（DNA双链断裂标志物）和Western Blot证实NVs降低了辐射引起的DNA损伤。透射电镜观察提供了直观证据：辐射组皮肤细胞线粒体肿胀、嵴结构破坏，并可见自噬空泡（线粒体自噬体）；而NVs治疗组线粒体结构更接近正常，线粒体自噬体减少。 * 安全性评估：溶血实验表明，即使在100 μg/ml的高浓度下，NVs的溶血率也低于5%的安全阈值。主要器官（心、肝、肺、肾）的H&E染色未发现明显病理改变，证明了NVs良好的血液相容性和体内生物安全性。
第五部分：基于DIA-MS的蛋白质组学深度机制挖掘 为系统揭示NVs作用的分子网络，研究对HSF细胞（分为对照组、辐射组、NVs治疗组）进行了数据非依赖采集质谱（Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry, DIA-MS）蛋白质组学分析。 * 分析流程：使用高分辨率的Orbitrap Astral质谱仪进行DIA数据采集，结合杂交谱图库进行蛋白鉴定和定量。随后进行差异表达蛋白分析、GO功能富集分析、KEGG通路富集分析、模糊聚类分析以及基因集富集分析（GSEA）。 * 关键发现： 1. DNA修复增强：分析鉴定出一组在辐射中下调、但经NVs处理后恢复表达的蛋白质（称为“NV挽救蛋白”）。这些蛋白显著富集于DNA损伤应答和修复通路，包括碱基切除修复、核苷酸切除修复等。具体上调的关键DNA修复蛋白包括POLD3, POLE4, RFC1和ERCC6。这从全局蛋白质组水平证实了NVs能增强细胞的DNA修复能力。 2. 线粒体自噬与相关通路调控：研究发现辐射特异性上调的蛋白与细胞外基质降解、炎症和凋亡相关，而NVs挽救的蛋白则与DNA修复、线粒体功能和代谢适应相关。对共享差异表达蛋白的分析进一步揭示了NVs对自噬/线粒体自噬通路的调控作用：NVs下调了辐射引起的自噬受体NBR1、TAX1BP1以及自噬相关因子EPG5、VPS11、VPS16等的异常表达。同时，NVs也抑制了辐射后PI3K/Akt/mTOR通路中Akt1和mTOR的异常激活。 3. 整合机制视图：蛋白质组学数据与之前的功能实验结果相互印证，共同勾勒出NVs的作用机制全景图：NVs通过其富含的线粒体代谢酶（如ATP5F1A/B）和抗氧化蛋白（如SOD2），“源头”改善线粒体能量代谢并清除ROS；通过抑制PINK1/Parkin通路和调节分裂/融合蛋白，恢复线粒体动力学稳态和正常线粒体自噬水平；通过下调异常的Akt/mTOR信号和自噬相关蛋白表达，纠正过度的自噬流；同时，通过上调一系列DNA修复蛋白，增强基因组稳定性。这些多方面的协同作用最终抑制了细胞凋亡，促进了组织修复。
三、 主要研究结果 本研究的结果环环相扣，从制备表征到机制挖掘，提供了完整的证据链： 1. 成功制备出高产、富含线粒体蛋白的hUMSC-NVs：物理表征符合纳米囊泡特征，蛋白质组学证实其线粒体蛋白富集度高达56.31%，功能富集分析指向能量代谢和线粒体质量控制，这为其命名为“ME-NVs”并预设其治疗RSI的潜力提供了基础。 2. 体外证实辐射诱导剂量依赖性的线粒体损伤与细胞凋亡：建立了可靠的HaCaT和HSF细胞辐射损伤模型，明确了辐射导致ROS升高、ΔΨm下降、线粒体自噬激活、线粒体碎片化及细胞死亡的关键表型，为评估NVs疗效提供了明确的“靶点”和检测指标。 3. 证实NVs可被皮肤细胞高效摄取并发挥多效性保护作用：NVs能有效减轻辐射引起的细胞活力下降、迁移抑制、ROS爆发和凋亡。机制上，NVs通过调节Bax/Bcl-2比例和p53/p21通路抑制凋亡；通过恢复ΔΨm、逆转线粒体碎片化、抑制PINK1/Parkin表达和调节Drp1/Mfn1/2平衡来修复线粒体功能与动力学。 4. 体内实验验证NVs对RSI具有显著治疗作用且安全性良好：在大鼠RSI模型中，NVs治疗能加速伤口愈合，改善组织病理（减少炎症、增加胶原和毛囊），促进血管新生，减少细胞凋亡和DNA损伤，并电镜下可见线粒体超微结构得到保护。安全性评估支持其潜在的临床应用前景。 5. 蛋白质组学深度揭示NVs协同调控DNA修复与线粒体质量控制的分子网络：DIA-MS分析提供了系统性的分子证据，表明NVs不仅能上调POLD3、ERCC6等关键DNA修复蛋白，还能广泛调节包括线粒体自噬（PINK1/Parkin, NBR1等）、自噬流（Akt/mTOR, EPG5等）和线粒体功能在内的复杂网络，从而协同维持细胞稳态。这超越了单一通路的解释，形成了全面的机制框架。
四、 研究结论与意义 本研究得出结论：源自hUMSCs的线粒体富集纳米囊泡（ME-NVs）是一种具有高生物相容性和靶向递送能力的新型无细胞治疗剂。它能够通过“多管齐下”的协同机制有效治疗辐射诱导的皮肤损伤：在功能层面，减轻炎症、促进胶原沉积和血管再生、抑制细胞凋亡；在分子机制层面，通过递送线粒体组分和调控信号网络，同时增强DNA修复能力、恢复线粒体能量代谢、清除过量ROS、纠正线粒体动力学失衡、并抑制过度的线粒体自噬。
该研究的科学价值在于：首次系统性地提出并验证了利用工程化、富含线粒体成分的纳米囊泡作为“线粒体疗法”载体，同时靶向RSI两大核心病理环节（DNA损伤与线粒体功能障碍）的治疗策略。它深化了对RSI分子病理的认识，并拓展了纳米囊泡在放射医学领域的应用。
其应用价值显著：ME-NVs结合了干细胞旁分泌益处和纳米技术的可控性优势，具有产量高、成分相对可控、安全性好、可规模化制备等特点，为开发临床级RSI治疗产品提供了有前景的新方向。此外，该策略也有潜力应用于其他由线粒体功能障碍和氧化应激相关的疾病。
五、 研究亮点 1. 策略创新性：首次将“线粒体富集”概念与“细胞膜衍生纳米囊泡”技术相结合，创造性地提出了一种同时靶向DNA修复和线粒体质量控制的协同治疗新范式。 2. 机制研究的系统性与深度：研究从形态、功能、蛋白表达等多个层面，综合运用体外细胞模型、体内动物模型以及前沿的DIA蛋白质组学技术，层层深入地揭示了ME-NVs的多重作用机制，构建了完整的证据体系。 3. 强大的转化潜力：所采用的NVs制备方法（机械挤压）简单、高效、易于放大，克服了天然EVs的生产瓶颈，且体内外安全性数据良好，为后续临床转化奠定了坚实的技术基础。 4. 研究设计的逻辑性与严谨性：工作流程设计合理，从表征到功能验证再到机制探索，步骤清晰，对照设置完善，结论支撑有力。
六、 其他有价值的内容 研究在讨论部分还结合了最新文献，将自身发现置于更广阔的学术背景中。例如，提到了PHB2、FUNDC1等线粒体自噬受体，以及线粒体-内质网应激（MERC）等前沿概念，指出ME-NVs的作用可能还涉及这些更复杂的细胞器互作和整合应激应答通路，为未来更深入的研究指明了方向。这显示了作者团队对该领域进展的深刻把握和研究视野的前瞻性。