本研究的主要作者为Yuan-Ta Lin和Jinsoo Seo（共同第一作者）以及通讯作者Li-Huei Tsai。作者团队主要来自麻省理工学院皮考尔学习与记忆研究所、脑与认知科学系，部分合作者来自哈佛医学院遗传学系和哈佛大学保尔森工程与应用科学学院。这项研究发表于《Neuron》期刊，最终正式版于2018年6月27日刊出。

学术背景 本研究属于神经科学，特别是阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease， AD）病理机制研究领域。载脂蛋白E e4等位基因（apolipoprotein E e4 allele， APOE4）是散发性阿尔茨海默病最强的遗传风险因素，但其在特定脑细胞类型中如何发挥作用并导致AD相关病理表型，尚未得到充分研究。传统上，AD被认为是神经元中心性疾病，但近期遗传学研究指出许多非神经元基因也是AD的重要风险因素。APOE在脑内主要由星形胶质细胞产生，但在神经元和小胶质细胞中也有表达。APOE4相较于常见的APOE3存在单氨基酸差异（Cys112Arg），导致蛋白质构象改变，影响其与脂蛋白受体、脂质和Aβ的结合。以往研究利用小鼠模型、细胞系和尸检样本发现APOE4与多种AD相关病理表型有关，如Aβ清除减少、tau蛋白病变、神经元毒性增加等，但这些研究受限于物种差异、难以获取相关人类细胞类型以及无法在体外模拟复杂疾病。近年来，基因组编辑和人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）分化技术的发展，使得在人类体外模型中系统研究APOE4对不同脑细胞类型的影响成为可能。

本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在健康受试者的iPSCs中构建同基因型（isogenic）的APOE4细胞系，并分化为神经元、星形胶质细胞和小胶质样细胞，从而在人类细胞类型特异性层面，全面探究APOE4如何引起广泛的分子和细胞水平改变，并与AD表型相关联。核心目标是阐明APOE4在AD发病机制中的细胞类型特异性功能，并验证将AD患者iPSC中的APOE4逆转为APOE3是否能缓解相关病理表型。

详细工作流程 本研究包含一系列严谨且递进的实验流程。 第一步，构建同基因型APOE4 iPSC系。 研究团队从一名未患病受试者的APOE3/APOE3纯合子iPSC（AG09173）出发，利用CRISPR/Cas9系统，通过定点编辑将APOE基因第112位密码子从编码半胱氨酸（Cys）的TGC改为编码精氨酸（Arg）的CGC，从而在蛋白质水平上将APOE3转变为APOE4。他们设计了针对APOE基因靶点的单导向RNA（sgRNA）以及包含突变序列的单链寡核苷酸供体DNA（ssODN），通过电穿孔将其共转染至iPSCs中。通过荧光激活细胞分选术（FACS）富集成功编辑的细胞，并通过有限稀释法挑选单克隆细胞株。通过Sanger测序确认基因编辑成功，并通过全外显子组测序验证未引入非预期的脱靶突变，核型分析也证实编辑后的细胞系无染色体异常。最终获得了一个与亲本细胞遗传背景完全一致（同基因型），仅在APOE位点存在差异的APOE4/APOE4纯合子iPSC系，以及一个作为对照的克隆（APOE4#2）。同时，研究还从一名散发性AD患者（AG10788， APOE4/APOE4）的iPSC出发，使用类似的策略将APOE4编辑回APOE3，构建了另一对同基因型细胞系，用于后续的“表型挽救”实验。 第二步，分化为特定脑细胞类型和大脑类器官。 从上述构建的同基因型iPSC系出发，研究团队分别将其分化为三种主要的脑细胞类型：1）神经元：采用神经源素2（Neurogenin2， Ngn2）介导的快速诱导分化方案，并优化培养条件，使用对照人星形胶质细胞的条件培养基而非共培养，以分离研究神经元自身APOE变异的影响。2）星形胶质细胞：通过诱导形成神经祖细胞，随后向星形胶质细胞谱系分化，并使用谷氨酸天冬氨酸转运体（GLAST）抗体通过FACS进行纯化。3）小胶质样细胞：采用一种已发表的将iPSC分化为具有小胶质细胞特征细胞的方案。4）大脑类器官：使用研究团队之前建立的3D培养方案，从iPSC生成大脑类器官。这些分化方案均经过转录组测序验证，产生的细胞表达各自的特异性标志物，且其转录组特征与已发表的人类脑样本或iPSC来源的对应细胞类型高度相似。 第三步，多组学与功能表征。 研究对分化得到的细胞进行了多层次的深入分析：1）转录组分析：对APOE3和APOE4的iPSC及三种分化细胞进行RNA测序（RNA-seq），鉴定差异表达基因，并进行基因共表达网络分析、基因本体论富集分析、转录因子和miRNA基序分析。同时，研究将iPSC来源细胞的转录组数据与880例人类脑样本的RNA-seq数据（来自正常对照和轻度认知障碍个体）进行比较，进行表达数量性状位点分析，寻找在人类大脑和iPSC模型中都受APOE4调控的细胞类型特征基因。2）神经元功能与病理分析：通过免疫荧光染色和3D成像定量分析突触密度（使用突触素和PSD-95作为标记）；通过全细胞膜片钳记录微型兴奋性突触后电流以评估突触传递功能；使用ELISA检测神经元分泌的Aβ40和Aβ42水平；通过免疫荧光标记早期内体抗原1（EEA1）来量化早期内体的数量和信号强度。3）星形胶质细胞功能与病理分析：通过免疫印迹和免疫荧光检测APOE蛋白的表达和分泌水平；通过filipin III染色结合显微镜成像、流式细胞术以及培养基中胆固醇检测试剂盒，分析细胞内和分泌的胆固醇水平；通过将细胞与寡聚化Aβ42共孵育，随后用ELISA检测培养基中Aβ42的清除率，以及通过免疫荧光直接观察细胞内Aβ42的摄取，来评估星形胶质细胞的Aβ吞噬功能；使用溶酶体抑制剂处理，探究Aβ42的溶酶体降解途径。4）小胶质样细胞功能与病理分析：通过形态学分析（突起数量和长度）评估其状态；通过实时活细胞成像，观察细胞摄取荧光标记的Aβ42的动态过程；将小胶质样细胞与过表达APP（APP duplication）且已形成Aβ聚集的AD模型类器官共培养一个月，随后通过免疫荧光评估类器官内Aβ积累的变化，以及共培养后小胶质样细胞形态的变化。5）大脑类器官病理分析：将APOE4和APOE3的iPSC分化为大脑类器官，培养至3个月和6个月，通过免疫印迹和免疫荧光检测类器官中APOE蛋白表达、Aβ积累以及tau蛋白磷酸化水平。6）表型挽救实验：使用从AD患者iPSC编辑得到的APOE3和APOE4同基因型细胞系，重复上述神经元、星形胶质细胞、小胶质样细胞和类器官的关键表型分析，以确认将APOE4逆转为APOE3能否缓解AD相关病理。

数据分析方面，生物信息学分析流程严谨。RNA-seq数据使用STAR进行比对，使用Cufflinks进行差异表达分析，使用加权基因共表达网络分析构建共表达模块。人类脑样本的外显子组和RNA-seq数据用于进行全基因组关联研究和eQTL分析。所有统计均采用合适的参数或非参数检验，数据以均数±标准误表示。

主要结果 转录组分析结果：RNA-seq分析显示，APOE4在iPSC来源的三种脑细胞类型中均引起广泛的转录组改变。神经元中有445个差异表达基因（DEGs），星形胶质细胞中有1327个，小胶质样细胞中最多，达1460个。基因共表达网络分析识别出一个包含857个与APOE表达模式同步变化的基因模块，该模块富集于脂质代谢、免疫反应和AD相关通路。转录因子基序分析发现，激活蛋白1（AP-1）的结合位点在所有脑细胞类型的DEGs以及APOE共表达模块基因的启动子区域均显著富集。重要的是，与人类脑样本的对比分析显示，APOE4在人类大脑和iPSC来源的细胞中对特定细胞类型的“特征基因”表达具有显著且一致的影响：神经元特征基因（如BDNF）多与突触功能相关且表达下调；星形胶质细胞特征基因（如PIK3C2A， CPNE3， EFR3B）与磷脂代谢过程相关；小胶质细胞特征基因则显著富集于免疫系统过程，且多为上调。这些APOE4相关基因的表达水平在人类患者中与皮层斑块密度和临床痴呆评分显著相关，验证了模型的临床相关性。 神经元表型结果：与APOE3神经元相比，APOE4神经元表现出加速成熟的表型：与神经元分化相关的基因表达上调；微型兴奋性突触后电流频率增加，表明突触前神经递质释放增加或突触密度增高；免疫荧光定量证实了突触数量显著增加。AD病理相关方面，APOE4神经元分泌的Aβ42水平增加了20%，而Aβ40无差异。此外，APOE4神经元中早期内体抗原1的阳性点数量及总信号强度均显著增加，表明早期内体数量增多。 星形胶质细胞表型结果：APOE4星形胶质细胞表现出明显的功能缺陷。首先，其细胞内APOE蛋白和mRNA水平以及分泌到培养基中的APOE水平均显著低于APOE3细胞。转录组分析显示，脂质代谢和转运相关基因表达发生显著变化。功能上，APOE4星形胶质细胞出现脂质代谢紊乱：filipin III染色显示细胞内胆固醇积累，培养基中也检测到分泌的胆固醇水平升高。最关键的是，APOE4星形胶质细胞的Aβ清除能力严重受损：ELISA和免疫荧光实验均证明其摄取和清除外源性寡聚Aβ42的效率显著低于APOE3细胞。溶酶体抑制剂实验表明APOE4细胞中Aβ的溶酶体依赖性降解也减少。 小胶质样细胞表型结果：APOE4小胶质样细胞在未受刺激的2D培养中表现出形态学异常，突起更少、更短。转录组分析显示，大量下调基因与细胞运动和发育相关，而329个上调基因中有三分之一与免疫反应相关，提示APOE4可能使小胶质细胞易于促炎。功能上，实时成像显示APOE4细胞摄取荧光标记Aβ42的速度远慢于APOE3细胞。在与AD模型类器官共培养后，APOE3小胶质细胞能显著减少类器官内的Aβ聚集，而APOE4小胶质细胞则效果不佳，同时其在类器官环境中的形态（突起长度）也与2D培养时不同，表明其对Aβ环境的感知和反应能力受损。 大脑类器官表型结果：与携带家族性AD突变的类器官在2个月就出现Aβ聚集相比，APOE4类器官的病理发展较慢。在培养6个月时（此时类器官中星形胶质细胞增多，APOE蛋白可被检测到），APOE4类器官表现出APOE蛋白水平降低，同时Aβ积累和tau蛋白磷酸化水平均显著高于APOE3类器官，证明APOE4等位基因本身足以在人类3D模型中引发AD核心病理特征。 表型挽救实验结果：将散发性AD患者iPSC中的APOE4编辑为APOE3后，大部分观察到的病理表型得到逆转或缓解：APOE3神经元的突触频率和数量减少；APOE3星形胶质细胞的APOE蛋白水平升高，胆固醇积累减少，Aβ摄取能力增强；APOE3小胶质样细胞的Aβ摄取能力恢复；APOE3类器官在6个月时的Aβ积累减少。这些结果强有力地证明了APOE4在这些AD相关表型中的核心致病作用。

结论与意义 本研究系统阐明了APOE4等位基因在人类iPSC来源的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中引发的一系列细胞类型特异性分子和功能改变。主要结论是：APOE4通过多种并行机制促进AD病理发生——在神经元中，它导致过早成熟、突触增多、早期内体异常，并轻度增加Aβ42的分泌；在星形胶质细胞和小胶质细胞这两种关键的神经胶质细胞中，APOE4严重损害了它们的Aβ清除和吞噬功能，其中星形胶质细胞还伴有APOE表达降低和胆固醇代谢紊乱，而小胶质细胞则表现出促炎基因激活和形态功能异常。这些胶质细胞功能的受损，可能是APOE4携带者大脑中Aβ清除效率低下、最终导致病理累积的关键。本研究建立的同基因型人类iPSC模型为理解APOE4在AD中的作用提供了一个强有力的参考框架。

研究的科学价值在于：1）在精确可控的人类遗传背景下，首次系统揭示了APOE4在三种主要脑细胞类型中的多层面影响，弥补了动物模型和混合遗传背景细胞研究的不足。2）明确了胶质细胞（特别是星形胶质细胞和小胶质细胞）的Aβ清除功能缺陷在APOE4相关AD病理中的核心地位，推动了从“神经元中心论”向“神经胶质细胞-神经元互作”视角的转变。3）通过基因编辑逆转实验，直接证实了APOE4等位基因对这些病理表型的因果关系，而非仅仅是关联。其应用价值在于：1）为开发针对APOE4携带者的新型疗法指明了潜在方向，例如增强胶质细胞的Aβ清除能力、调节脂质代谢或抑制小胶质细胞的异常炎症反应。2）所建立的同基因型iPSC细胞系和分化模型，可作为强大的药物筛选和机制研究平台。3）研究提示，针对胶质细胞功能和脂质稳态的干预，可能比单纯靶向神经元或Aβ产生更为有效。

研究亮点 1. 模型系统创新性：创造性地结合CRISPR/Cas9基因编辑与iPSC分化技术，构建了遗传背景完全匹配的APOE3/APOE4同基因型人类脑细胞模型，极大减少了遗传背景噪音，使精确解析APOE4的细胞自主性效应成为可能。 2. 研究视角全面性：首次在同一研究体系中平行探究APOE4对神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞这三种关键脑细胞类型的影响，并整合了2D单细胞培养、共培养和3D类器官模型，模拟了细胞间相互作用，提供了前所未有的全景式视角。 3. 表型-功能紧密关联：研究不仅停留在转录组变化的描述，更深入进行了从电生理、形态学到吞噬功能等一系列精细的细胞功能学验证，将分子变化与AD核心病理生理过程（Aβ代谢、突触功能、炎症）直接联系起来。 4. 临床转化与机制验证并重：通过将AD患者细胞中的APOE4逆转为APOE3进行“表型挽救”，提供了最强有力的遗传因果证据，同时明确指出了可干预的细胞功能和通路，具有直接的转化医学启示。 5. 数据整合深度：将体外模型的转录组数据与大规模人类脑样本数据库进行整合分析，验证了体外发现的人类疾病相关性，增强了研究结果的可靠性和临床意义。