该研究由Yufeng Yao、Qixue Song、Changqing Hu等学者合作完成，主要通讯作者为Chengqi Xu、Qiuyun Chen及Qing K. Wang。研究团队来自华中科技大学生命科学与技术学院人类基因组研究中心、湖北医药学院基础医学院生理学系，以及美国克利夫兰诊所勒纳研究所心血管与代谢科学系等机构。该论文发表于《Cardiovascular Research》期刊，于2022年正式刊出，属于心血管与糖尿病交叉领域的基础研究。
糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者的心血管并发症是导致其死亡和致残的主要原因之一。尽管临床上对血糖进行了严格控制，但部分患者的大血管和微血管并发症仍持续存在或甚至进展，这一现象被称为“代谢记忆”（metabolic memory）。代谢记忆最初由Nathan等人在2005年针对糖尿病患者治疗结果的分析中提出，后来Aschner和Ruiz将其进一步定义为高血糖对血管并发症产生的长期不良效应，即使血糖控制改善也难以逆转。既往研究提示，高血糖引起的内皮细胞功能障碍、氧化应激、炎症及纤维化可能在其中发挥关键作用，但其具体分子机制尚不清楚。
该研究的主要目的是鉴定高血糖诱导内皮细胞（endothelial cells，ECs）代谢记忆的分子机制，并证明该机制在糖尿病心血管功能障碍发生中的关键作用。研究围绕内皮-间充质转化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）、核因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、微小RNA（microRNA，miRNA）及转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路展开，试图揭示一条新的信号轴及其在糖尿病心肌病和心脏血管周围纤维化中的作用。
该研究的工作流程可以分为体外细胞实验和体内动物实验两大部分。体外实验使用两种内皮细胞：人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs）和小鼠心脏微血管内皮细胞（mouse cardiac microvascular endothelial cells，MCMECs）。研究设置了三组基本培养条件：正常葡萄糖（normal glucose，NG，5.6 mM D-葡萄糖加29.4 mM L-葡萄糖作为渗透压对照）、高葡萄糖（high glucose，HG，35 mM D-葡萄糖）以及高糖转低糖（HG-NG，即先在高糖中培养4天，再切换至正常葡萄糖培养4天）。所有处理均持续8天，以观察代谢记忆效应。
研究者首先检测了EndMT相关标志物的表达，包括内皮标志物CD31（由PECAM1基因编码）和间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。通过免疫荧光染色、实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和Western blotting分析发现，HG处理显著增加α-SMA表达并降低CD31表达，且在HG-NG条件下这种变化仍然持续，表明EndMT存在代谢记忆。同时，Western blotting检测了磷酸化Smad2（p-Smad2）、磷酸化Smad3（p-Smad3）、总Smad2/3蛋白、磷酸化p65（p-p65）以及Nrf2的蛋白水平。结果显示，HG诱导的p-Smad2、p-Smad3和p-p65升高以及Nrf2表达下调在HG-NG组中并未恢复，进一步证实了信号通路的代谢记忆特征。这些结果在MCMECs中也得到了重复验证。
为了明确Nrf2下调在代谢记忆中的必要性，研究人员使用了Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，tBHQ）。tBHQ通过抑制Nrf2的泛素化降解来提高其蛋白水平。结果显示，tBHQ可逆转HG-NG诱导的EndMT：CD31表达升高，α-SMA表达降低，同时p-Smad2、p-Smad3和p-p65水平下降。tBHQ不影响Nrf2 mRNA水平，但显著提高Nrf2蛋白水平，提示其作用发生在蛋白稳定性层面。这说明Nrf2蛋白下调是HG诱导EndMT代谢记忆所必需的。
在机制解析部分，研究者重点关注了靶向Nrf2 mRNA 3ʹ非翻译区（3ʹ-untranslated region，3ʹ-UTR）的miRNA。通过生物信息学分析，他们发现Nrf2 mRNA的3ʹ-UTR上有多个miRNA结合位点。在HUVECs和MCMECs中，只有miR-27a-3p在HG和HG-NG条件下均持续上调。进一步实验显示，转染miR-27a-3p模拟物（mimics）可降低Nrf2蛋白水平但不影响其mRNA水平；而miR-27a-3p抑制剂则增加Nrf2蛋白水平并激活Nrf2下游信号。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-27a-3p可直接结合Nrf2 mRNA的3ʹ-UTR。此外，研究者还发现NF-κB亚基p65可结合miR-27a基因启动子区域，且通过siRNA敲低p65可降低miR-27a表达，双荧光素酶实验也证实p65直接调控miR-27a启动子活性。因此，HG激活NF-κB（p65），进而上调miR-27a-3p，后者通过靶向Nrf2的3ʹ-UTR下调其蛋白水平，从而促进EndMT并形成代谢记忆。
在细胞功能层面，研究者还检测了活性氧（reactive oxygen species，ROS）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和线粒体耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）。结果显示，HG显著升高ROS水平并降低NO水平，HG-NG切换后这些变化仍未恢复；但使用tBHQ或miR-27a-3p抑制剂可部分逆转。同时，HG导致线粒体OCR降低，HG-NG组无恢复，而tBHQ和miR-27a-3p抑制剂可改善OCR。这些结果表明，氧化应激和线粒体功能障碍是代谢记忆的重要组成部分，且Nrf2和miR-27a-3p在调控这些过程中起核心作用。
动物实验部分采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病小鼠模型。雄性BALB/c小鼠随机分为五组：正常对照组（sham）、糖尿病组（STZ）、胰岛素治疗组（STZ+insulin）、胰岛素联合tBHQ治疗组（STZ+insulin+tBHQ）以及胰岛素联合miR-27a-3p抑制剂治疗组（STZ+insulin+miR-27a-3p inhibitor）。STZ诱导12周后开始治疗，持续12周。结果显示，胰岛素治疗虽然显著降低血糖水平，但未改善左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和心肌功能；而联合使用tBHQ或miR-27a-3p抑制剂可显著恢复LVEF和心脏功能。心脏重量/体重比（heart weight/body weight，HW/BW）也在联合治疗组中显著下降。
组织学分析显示，糖尿病小鼠心脏血管周围胶原沉积明显增加，胰岛素单独治疗无改善，但联合治疗可显著减少Masson染色和天狼星红染色显示的胶原积累，并降低I型和III型胶原的免疫组化信号。此外，糖尿病小鼠心脏组织中p-p65、miR-27a-3p、p-Smad2和p-Smad3水平升高，Nrf2蛋白水平下降，这些变化在胰岛素单独治疗组中持续存在，而联合治疗可逆转上述信号变化。这进一步在体内验证了NF-κB/miR-27a-3p/Nrf2/ROS/TGF-β/EndMT信号通路在代谢记忆中的作用。
该研究的主要发现可归纳为以下几点。第一，高血糖可诱导内皮细胞产生代谢记忆，表现为NF-κB信号激活、miR-27a-3p上调、Nrf2蛋白下调、TGF-β信号增强以及EndMT的持续发生，即使血糖恢复正常后这些变化仍然存在。第二，Nrf2蛋白下调是EndMT代谢记忆的关键环节，且其调控发生在转录后水平而非转录水平。第三，miR-27a-3p直接靶向Nrf2 mRNA的3ʹ-UTR，从而负调控Nrf2蛋白表达；而NF-κB（p65）可转录激活miR-27a基因。第四，使用Nrf2激活剂tBHQ或miR-27a-3p抑制剂可阻断内皮细胞的代谢记忆，恢复NO产生，减少ROS生成，改善线粒体功能，并抑制EndMT。第五，在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中，单纯胰岛素治疗虽然降低血糖，但不能改善心脏功能或纤维化；而联合tBHQ或miR-27a-3p抑制剂治疗可显著改善心脏功能并减轻血管周围纤维化。
该研究首次完整地鉴定了内皮细胞代谢记忆的分子信号通路，即NF-κB/miR-27a-3p/Nrf2/ROS/TGF-β/EndMT正反馈环路。这一发现不仅揭示了糖尿病心血管并发症在血糖控制后仍持续进展的潜在原因，还提示Nrf2和miR-27a-3p可作为潜在的治疗靶点。研究同时强调了在糖尿病治疗中，仅仅控制血糖可能不足，必须同时阻断代谢记忆才能有效改善心血管结局。
本研究的亮点在于：第一，首次明确了NF-κB/miR-27a-3p/Nrf2/ROS/TGF-β/EndMT这一完整信号轴在内皮细胞代谢记忆中的作用，将炎症、氧化应激与纤维化过程紧密联系起来。第二，研究通过体外与体内实验相结合，系统地证明了代谢记忆的存在及其可干预性，尤其是发现了Nrf2蛋白翻译后调控机制的关键作用。第三，在动物模型中，研究者采用了“诱导糖尿病12周—胰岛素治疗12周”的设计，模拟了临床中血糖控制后并发症仍持续的情景，为代谢记忆相关治疗策略提供了更具转化意义的数据支持。
研究还观察到高糖可下调miR-29家族（miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-29c-3p）的表达，这一变化在HG-NG条件下依然持续，而tBHQ或miR-27a-3p抑制剂可恢复其表达。同时，多种促纤维化基因如COL1A1、COL5A1、PDGFC、IL4R、ELN、ADAMTS9和ADAMTS12在HG和HG-NG条件下显著上调，联合治疗可抑制这些变化，进一步表明miR-29家族在代谢记忆相关纤维化中位于Nrf2和miR-27a-3p下游。
研究也讨论了线粒体晚期糖基化终末产物在代谢记忆中的可能作用，认为线粒体功能障碍和ROS产生可能是代谢记忆长期维持的重要因素之一。同时，作者指出本研究使用的葡萄糖浓度和STZ剂量较高，未来需要在更接近临床的低剂量模型中进一步验证。此外，研究主要聚焦于内皮细胞，未来还需探讨心肌细胞和心脏成纤维细胞在高糖记忆中的作用。