作者及研究机构：本文研究由Fangli Peng、Dan Jiang、Wei Xu、Yining Sun、Zhiwei Zha、Xiying Tan、Jinjie Yu、Chengjie Pan、Qinxiang Zheng和Wei Chen合作完成，主要来自中国浙江省温州医科大学眼视光学院及眼科医院，研究成果发表于2022年11月《Invest Ophthalmol Vis Sci》（IOVS）期刊，第63卷第12期，文章编号为18。

学术背景：干眼病（dry eye）是一种严重影响视力与生活质量的重要健康问题，其核心病理机制为泪液高渗性，导致活性氧（ROS）过度产生，进一步加剧线粒体损伤。线粒体动力学，包括线粒体分裂（fission）与融合（fusion），在维持线粒体稳态中扮演重要角色。但过度分裂会破坏正常的线粒体功能，诱发氧化损伤、细胞死亡及炎症反应。在这种背景下，本文聚焦腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）与线粒体分裂因子（MFF）通路，通过研究其对线粒体分裂和线粒体自噬（mitophagy）的调控作用，探索干眼病的潜在发病机制以及相关治疗策略。

研究目标：本文旨在评估线粒体形态与AMPK/MFF信号通路在干眼中的作用，探讨线粒体动力学变化与能量代谢紊乱之间的关系，并分析抑制该通路对干眼病治疗的潜在价值。

研究流程与实验方法：

研究分为体外及体内实验两部分，通过多步骤开展：

体外实验

1. 细胞模型构建：利用永生化人角膜上皮细胞（HCECs）和原代HCECs，分别培养于等渗（312 mOsm）和高渗（500 mOsm）条件下，模拟泪液高渗环境。
   
2. 实验观察：
   • 使用定量实时PCR（qPCR）检测相关mRNA的表达水平；
   • 通过蛋白质印迹法（Western blot）和免疫荧光染色评估蛋白表达；
   • 使用共聚焦显微镜和透射电子显微镜（TEM）观察线粒体形态变化。
3. 自噬与线粒体自噬评估：采用LC3和p62等标志蛋白评估自噬活性；通过Bafilomycin A1抑制实验验证自噬流变化。
4. 信号通路研究：基于AMPK/MFF/DRP1轴进行深入探索，分别应用siRNA敲降AMPK表达，及AMPK激动剂AICAR进行激活，观察各下游信号与细胞变化。

体内实验

1. 动物模型构建：选用6-8周龄C57BL/6雌性小鼠，采用东莨菪碱（Scopolamine）皮下注射及低湿度环境联合诱导干眼模型。
   
2. 评估指标：
   • 使用荧光显微镜评估小鼠眼表角膜损伤和活性氧水平；
   • 检测角膜上皮细胞中Fis1等分裂蛋白以及AMPK/MFF相关信号通路关键分子水平。
     

研究结果

线粒体氧化损伤与分裂

• 在高渗应激HCECs中，ROS显著升高（荧光显微镜检测显示），表现为线粒体短小化、嵴结构紊乱及分裂蛋白Fis1水平增高。
  
• 在体内实验中，干眼小鼠角膜染色评分显著升高，角膜及结膜组织中Fis1水平同样显著增加。
  

自噬与线粒体自噬的过度激活

• 高渗条件下，LC3-II蛋白表达显著升高，同时观察到更多未降解的自噬溶酶体，提示存在过度的自噬及线粒体自噬活性。
  
• 在干眼小鼠中，自噬标志蛋白LC3及p62亦显示表达显著增加。

AMPK/MFF通路的激活

• 多基因集富集分析表明高渗环境引起HCECs能量代谢紊乱，AMPK磷酸化水平显著升高，激活下游MFF并促进细胞质中DRP1向线粒体外膜募集，进一步介导线粒体分裂。体内实验中，小鼠结膜中AMPK和MFF的活化水平同样显著升高。
  

抑制AMPK/MFF改善病理状态

• 敲降AMPK显著降低HCECs中MFF磷酸化水平、DRP1募集及线粒体碎片化，同时减轻ROS生成，提升细胞活力。
  
• MFF敲降实验进一步证实，抑制MFF不仅减弱线粒体分裂，而且可缓解细胞氧化损伤及炎症因子表达（如NLRP3、TNF-α）。
  

结论及意义

本文研究首次全面揭示了AMPK/MFF/DRP1信号通路在干眼中通过调控线粒体分裂和线粒体自噬所起的关键作用，明确了线粒体动力学失调在干眼发生中的核心病理机制；研究还证实了AMPK/MFF抑制对减轻氧化应激及炎症、改善细胞活力的潜在治疗价值。这为干眼病新型治疗策略提供了重要的实验依据，并可能进一步指导临床干眼病药物研发。

研究亮点

• 系统性探讨了线粒体动力学与能量代谢紊乱在干眼中的作用；
  
• 通过体内外联合实验验证了AMPK/MFF/DRP1信号通路的核心调控作用；
  
• 提供了干眼基于线粒体分裂抑制的全新治疗思路。
  

研究展望

本文未能对体内干眼小鼠的线粒体自噬与形态变化进行深入分子生物学验证，这为未来研究方向提供了空间。此外，结合相关基因干预技术进一步研究干眼的分子机制将成为下一步工作重点。