通过祖先酶还原胺化去对称化合成轴向手性联芳基苄胺的研究报告

作者、机构及发表信息

本项研究的主要作者包括Wen-Qing Zheng、Xin-Xin Zhu、Zheng Zhu、Tairan Yang、Lifen Zheng、Rui Pan、Shenlin Wang、Lixin Zhang、Qi Chen、Jian-He Xu、Yongtao Xie*和Gao-Wei Zheng*等，作者单位均为华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室。该研究以Access to Axially Chiral Biaryl Benzylamines via Ancestral Enzyme-Enabled Reductive Amination Desymmetrization为题，于2025年1月11日发表在ACS Catalysis期刊上（ACS Catal. 2025, 15, 3, 1522-1531），DOI号为10.1021/acscatal.4c06881。

学术背景

本研究属于生物催化不对称合成领域，聚焦轴向手性联芳基苄胺的立体选择性合成。轴向手性联芳基结构广泛存在于天然产物（如万古霉素、秋水仙碱类似物）、药物分子和手性配体/催化剂中。尽管金属催化和有机催化方法已被开发用于构建联芳基骨架，但针对联芳基苄胺的直接不对称合成仍面临挑战。传统方法依赖手性底物的转化或动态动力学拆分(Dynamic Kinetic Resolution, DKR)，但存在步骤冗长、底物受限等问题。

研究团队创新性地提出通过联芳基二醛的还原胺化去对称化(Reductive Amination Desymmetrization)策略，利用工程化的祖先亚胺还原酶(Ancestral Imine Reductases, AncIReds)催化该反应。这一策略的优势在于：(1)使用易得的二醛底物；(2)产物中保留的醛基可用于衍生化；(3)生物催化条件温和环保。研究目标是通过定向进化获得高选择性酶催化剂，建立绿色高效的轴向手性苄胺合成平台。

详细工作流程

1. 酶库筛选与优化

研究团队首先对实验室已有的174种现存IRed和18种祖先IRed进行筛选，以联芳基二醛1和环丙胺A为模型底物。结果显示72%的祖先酶表现出优于现存酶的活性和选择性。其中，祖先酶N15与炔丙胺B组合效果最佳，转化率达78%，目标产物比例为78%。

2. 定向进化

基于分子对接结果，选择活性位点附近的8个残基(N95、M121、V123、L174、M177、W208、S232、M236)进行突变。通过构建”智能突变库”，获得5个有益单点突变体(M177W、N95T、S232A、S232L、V123T)。将这些突变组合后，双突变体M177W/V123T(命名为M2)将目标产物比例提升至83%。

通过两轮进化路线最终获得两个最佳突变体： - 五重突变体N15-M5-R1(N95T/G176A/V123T/M177W/S232A)：转化率90%，产物比例86%，对映体过量值(Enantiomeric Excess, ee)>99% - 四重突变体N15-M4-R2(V123T/M177W/W208F/S232A)：转化率96%，选择性90%

3. 底物范围考察

使用优化酶N15-M4-R2和N15-M5-R1测试了多种联芳基二醛和胺类底物： - 醛底物适应性：2’-位上含甲基、乙基、甲氧基等给电子基的底物(1b-3b)转化率72-97%；乙烯基底物(4b)产率72%，ee值99%；含Cl、Br、CF₃等吸电子基的底物(5b-7b)表现良好；3’/4’/5’位取代底物(8b-13b)转化率81-99%；萘环底物18b也能顺利转化 - 胺底物适应性：碳链延长的炔丙胺(1c)转化率67%；烯丙胺(13d)适用；含OMe和CF₃的胺类(17e/f)化学选择性有所下降 - 多数案例中产物与副产物的比例>90:10

4. 放大实验与产物衍生化

开展了半制备规模反应，产物1b和4b的产率分别为69%和50%。产物中的醛基可进一步转化： - NaBH₄还原得到手性苄醇19b - NHC催化剂(N-杂环卡宾)催化转化为氰基产物20b(51%收率，99% ee) 通过化学衍生和HPLC比对，确定酶催化产物的绝对构型为R型

5. 机理研究

通过分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟和MM/GBSA结合能计算阐明了立体选择性机制： - R构型亚胺中间体1b’与NADPH的C3-C4距离(N15:6.9 Å；N15-M4:4.7 Å)明显短于S构型(N15:16.9 Å；N15-M4:9.8 Å) - N15-M4与R-1b’的结合能(-25.5±2.1 kcal/mol)低于S-1b’(-24.7±2.5 kcal/mol) 计算结果与实验观察到的R构型产物优势一致

主要结果与逻辑关联

1. 酶库筛选证明祖先酶在活性和选择性上优于现存酶，为后续进化奠定基础
2. 定向进化获得的突变体M4-R2和M5-R1显著提高了转化率和立体选择性，关键突变如W208F通过增加空间位阻改善选择性
3. 底物扩展证实该方法对电子效应和位阻差异的广泛耐受性，展现了合成多样性
4. 放大实验验证了该方法的应用潜力，产物衍生化展示了后续修饰的灵活性
5. 机理研究从原子层面解释了立体选择性起源，为理性设计提供了依据

各部分结果环环相扣：筛选获得起始酶，进化优化性能，验证普适性，最后探究机制，构成了完整的研究链条。

结论与价值

本研究首次实现了通过祖先IRed催化的还原胺化去对称化反应高效构建轴向手性联芳基苄胺，具有重要的科学和应用价值：

科学价值 1. 拓展了生物催化在轴向手性化合物合成中的应用边界 2. 证实祖先酶重构策略在复杂不对称合成中的优势 3. 为立体选择性控制机制提供了新的认识

应用价值 1. 开发了一种条件温和、步骤简洁的绿色合成方法 2. 产物结构多样，可用于药物和农业化学品开发 3. 剩余醛基为后续衍生化提供了多功能位点 4. 为相关手性配体/催化剂的设计提供了新思路

研究亮点

1. 方法创新：首次将祖先酶工程与还原胺化去对称化相结合，克服了传统方法中过度胺化和醛基还原等副反应
2. 性能优异：获得高达99%的转化率和99% ee值，产物/副产物比例达97:3
3. 底物广泛：适用于各类电子效应的联芳基二醛和结构多样的胺类
4. 机制解析：通过分子模拟阐明立体控制机制，为类似研究提供参考
5. 实用性：完成克级规模示范，产物易于衍生化

其他有价值内容

1. 本研究与同期报道的使用现存IRed的工作相比(Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202416569)，突出了祖先酶在热稳定性和催化可塑性方面的优势
2. 建立的”智能突变库”策略可高效筛选有益突变，减少实验工作量
3. 产物绝对构型的确定为后续不对称合成研究提供了重要参考
4. 研究成果已申请专利保护，体现了其潜在商业价值

该研究为轴向手性化合物的绿色合成提供了新思路，推动了生物催化在精细化学品合成中的应用。作者表示正在基于该成果开发新型农用和药用活性分子，以及相关手性催化剂/配体。