本文发表于 Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity 期刊，2025年6月28日在线发表。第一作者为Rucui Yu，通讯作者为Rucui Yu和Xiangqing Chen，研究机构为中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）中医科和药学部，以及中国人民解放军联勤保障部队第901医院肛肠科。该研究受国家自然科学基金等项目资助。

研究背景

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要病因。目前DN的治疗主要包括营养干预、控制血糖和血压、使用降糖药物及抑制肾素-血管紧张素系统药物，但这些措施仅能延缓疾病进展，无法有效逆转肾损伤。近年来，中药在改善DN方面显示出一定优势。益气养阴通络方（Yiqi Yangyin Tongluo Formula, YQYTLF）已在临床中显示出改善DN的作用，但其分子机制尚未完全阐明。网络药理学作为一种基于大数据和生物信息学的方法，适合分析中药复方多靶点、多通路的作用特点。因此，本研究旨在通过网络药理学和动物实验验证，探索YQYTLF缓解DN的作用机制，重点关注AGE-RAGE信号通路。

研究流程

本研究主要包括网络药理学分析和DN大鼠模型实验验证两大部分。第一部分为网络药理学分析。首先，研究者利用TCMSP数据库筛选YQYTLF中15味中药的活性成分，筛选标准为口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%且类药性（drug-likeness, DL）≥0.18，并利用HERB数据库补充活性成分。共获得192个化合物，去重后得到170个化合物。随后预测这些化合物的靶基因，去重后保留143个靶基因。利用Cytoscape 3.10.2构建“中药-化合物-靶点”网络，该网络包含390个节点和1786条边。接着，从GEO数据库的GSE104948数据集中获取DN肾组织与正常组织的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），筛选标准为p<0.05。将药物靶点与疾病靶点进行交集分析，获得99个YQYTLF治疗DN的潜在靶点。对这些靶点进行GO和KEGG富集分析。GO分析显示，核心基因主要参与细胞转录调控、信号转导、应激反应和炎症等生物学过程，定位于质膜和细胞外区域，并在细胞信号、基因调控、细胞凋亡、细胞周期调控、氧化应激和代谢调节中发挥作用。KEGG富集分析显示，AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和IL-17信号通路显著富集。随后，利用STRING平台构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并通过Cytoscape中的CytoHubba插件根据Degree和MCC排名筛选核心靶点，去重后得到13个核心靶点。其中8个核心靶点（JUN、STAT3、IL6、TNF、CASP3、AKT1、BCL2、TP53）富集在AGE-RAGE信号通路中。此外，通过KEGG平台通路映射证实YQYTLF靶点主要富集在AGE-RAGE信号通路。最后进行分子对接分析，将排名前三的活性化合物（quercetin、luteolin、kaempferol）与核心靶点进行对接。共获得15个有效分子对接结果，所有结合能均低于-5.0 kcal/mol，其中13个（86.7%）结合能低于-7.0 kcal/mol，表明活性化合物与靶蛋白之间存在强结合作用。

第二部分为动物实验验证。研究者建立了DN大鼠模型。24只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为对照组、DN组、生理盐水组和YQYTLF组，每组6只。对照组给予正常饮食，其余大鼠给予高脂饮食（high-fat diet, HFD）3周后，腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）30 mg/kg/天，连续10天，诱导糖尿病。血糖≥15 mM（连续两次空腹测量）的大鼠视为造模成功。YQYTLF组大鼠给予益气养阴通络方灌胃治疗，剂量按体表面积折算为0.418 g/kg。实验期间每周监测体重、摄食量和饮水量。第28天收集24小时尿液，取血检测空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）、空腹胰岛素（fasting insulin, FINS）、血清肌酐（serum creatinine, SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）和尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate, UAER），并计算HOMA-β和HOMA-IR指数评估β细胞功能和胰岛素抵抗。同时记录大鼠瘙痒行为并进行瘙痒评分。取肾组织称重计算肾指数。肾脏病理通过HE染色和Sirius Red染色评估。肾组织中AGEs水平、氧化应激标志物（ROS、MDA、GSH、SOD）通过ELISA和生化分析检测，RAGE蛋白表达通过Western blot检测。

主要研究结果

在网络药理学分析部分，研究者发现YQYTLF中排名前三的活性化合物均为黄酮类化合物：quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）和kaempferol（山柰酚）。黄酮类化合物已知具有抗糖尿病、抗氧化、抗高血压和抗炎等药理活性。具体而言，quercetin具有抗氧化、抗过敏、抗炎和抗凋亡活性；luteolin通过抗炎作用缓解DN；kaempferol通过抗氧化和抗炎作用保护肾脏、减轻肾纤维化。这些结果提示YQYTLF的主要活性成分可能通过抗炎和抗氧化途径发挥作用。13个核心靶点中有8个富集在AGE-RAGE信号通路，AGEs与RAGE结合可介导氧化应激和慢性炎症，导致肾脏损伤，且AGE-RAGE信号可促进NF-κB表达。

在动物实验中，DN组大鼠从第2周到第4周表现出体重下降、摄食量和饮水量增加，YQYTLF治疗有效逆转了这些症状。DN组大鼠FBG和FINS水平显著升高，YQYTLF治疗显著降低了这些水平。YQYTLF还改善了HOMA-β指数并降低了HOMA-IR指数。在肾功能评估中，DN大鼠的SCr、BUN和UAER显著升高，YQYTLF治疗有效抑制了HFD/STZ诱导的这些指标升高。此外，DN大鼠表现出瘙痒行为和肾指数增加，YQYTLF治疗后均显著改善。HE染色显示DN大鼠肾脏出现Bowman囊扩张和系膜增生，YQYTLF治疗后明显改善。Sirius Red染色显示糖尿病大鼠存在肾间质纤维化，YQYTLF治疗有效减轻了纤维化。

在机制验证方面，ELISA结果显示糖尿病大鼠肾组织中AGEs水平显著升高，YQYTLF治疗有效降低AGEs水平。生化分析显示DN大鼠肾组织中ROS和MDA水平升高，YQYTLF治疗后显著下降，表明YQYTLF减轻氧化应激。同时，YQYTLF治疗显著逆转了肾组织GSH和SOD水平的降低，提示其支持肾脏抗氧化防御系统。Western blot分析证实糖尿病大鼠肾组织中RAGE表达显著升高，YQYTLF治疗逆转了这一升高。这些结果表明YQYTLF抑制AGE-RAGE轴激活，减轻氧化应激，保护肾脏组织。

分子对接结果显示，所有15个化合物-靶点复合物的结合能均低于-5.0 kcal/mol，其中luteolin与TNF的结合能最低（-6.5 kcal/mol），表明YQYTLF的关键成分与核心靶点具有强结合亲和力，为调节AGE-RAGE轴等DN相关通路提供了结构基础。

结论与意义

本研究通过网络药理学分析和DN大鼠模型实验，证实YQYTLF通过抑制AGE-RAGE轴激活和减少肾脏氧化应激发挥肾保护作用。这一发现为DN的后续治疗提供了潜在的新策略。本研究的科学价值在于将网络药理学预测与动物实验验证相结合，系统揭示了YQYTLF治疗DN的分子机制，特别是明确了AGE-RAGE信号通路在其中的核心作用。应用价值在于为益气养阴通络方在DN临床治疗中的应用提供了理论依据，也为中药复方治疗DN的机制研究提供了可借鉴的研究范式。

研究亮点

本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，采用网络药理学与动物实验验证相结合的研究策略，从系统层面预测中药复方的作用靶点和通路，再通过体内实验进行验证，提高了研究结论的可靠性。第二，明确了YQYTLF主要通过AGE-RAGE信号通路发挥作用，并鉴定出8个富集于该通路的核心靶点，为深入理解该方的药理机制提供了具体分子靶点。第三，发现YQYTLF中排名前三的活性化合物均为黄酮类化合物，并阐明了它们在抗氧化和抗炎方面的作用。第四，动物实验中不仅评估了血糖和肾功能指标，还检测了AGEs、氧化应激标志物和RAGE蛋白表达，形成了从上游AGEs到下游氧化应激的完整机制链路。不过研究也存在一定局限，例如缺乏临床样本验证，核心活性成分在复方中的具体贡献尚需进一步阐明，对AGE-RAGE下游通路如NF-κB和MAPKs的影响也有待深入研究。