本研究由苏州大学附属第一医院骨科的夏宇（Yu Xia）、葛高然（Gaoran Ge）、肖海翔（Haixiang Xiao）等研究人员完成，通讯作者为顾成勇（Chengyong Gu）、杨惠林（Huilin Yang）和耿德春（Dechun Geng）。该研究于2023年发表在*Cell Death and Disease*期刊上（2023;14:631），DOI为10.1038/s41419-023-06160-w。研究得到了国家自然科学基金（82072425、82072498、82272157）等多项基金的资助。
骨质疏松症作为一种全球性公共健康问题，主要表现为骨折风险增加和骨微结构损伤。由于难以找到各类骨质疏松症之间的共性，该疾病的治疗效果一直不理想。临床研究表明，骨质疏松症是多种导致体内慢性铁蓄积疾病的常见并发症，如地中海贫血、镰状细胞病（SCD）和遗传性血色素沉着症（HH）等。在6至10岁地中海贫血患儿中，55.1%存在骨密度降低（脊柱骨密度Z评分<−1SD），而20岁以上成人中该比例高达87.4%。约72%的SCD成人患者存在低骨密度，约25%至34%的HH患者表现出骨质疏松症状。铁过载（iron overload）已被反复报道与抑制成骨细胞活性和诱导细胞凋亡相关，因此被认为是多种类型骨质疏松的独立风险因素。
REPIN1（replication initiator 1）是一种分子量为60 kDa的锌指蛋白，其基因定位于人类7号染色体。REPIN1因在DNA复制中的增强作用被认为是复制起始特异性DNA结合蛋白。已有研究表明REPIN1可能参与脂肪生成、葡萄糖和脂肪酸转运、脂滴形成与融合等过程，但其是否通过调控铁代谢影响骨质疏松的发生此前尚无报道。本研究旨在探究REPIN1在铁代谢相关骨质疏松中的关键调控作用及其分子机制。
本研究采用了临床标本、动物模型和体外细胞实验相结合的多层次研究策略。
临床标本检测。 研究者首先从基因表达综合数据库（GEO，GSE35958）获取原始数据进行分析，发现骨质疏松组中REPIN1表达升高（log FC = 6.33）。随后收集了接受全髋关节置换术患者的骨组织样本，根据术前股骨颈骨密度将样本分为骨质疏松组和对照组。通过Western blotting和定量实时PCR（qRT-PCR）检测REPIN1的蛋白和mRNA表达水平，并检测了骨组织中铁蓄积情况。
动物模型构建。 采用改良的Tsay方法构建铁过载诱导的骨质疏松小鼠模型：6周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、FAC组、NC+FAC组和sh-REPIN1+FAC组，后三组腹腔注射枸橼酸铁铵（FAC，40 mg/kg/3天）持续8周。同时还构建了卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型以验证REPIN1调控的普适性。sh-REPIN1慢病毒通过股骨骨骺过渡区的骨膜和皮质注入骨髓腔，每两周注射一次。8周后处死小鼠，取股骨进行micro-CT扫描、H&E染色、茜素红双标记实验和普鲁士蓝染色，取胫骨进行蛋白和RNA分析。micro-CT参数包括骨密度（BMD）、骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）、骨表面积/骨体积比（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp），分析区域从生长板下方100个切片开始，读取150个切片（每个6 µm）。
体外细胞实验。 使用MC 3T3-E1细胞系和从小鼠股骨胫骨中提取的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。BMSCs通过冲洗4周龄雄性C57BL/6小鼠股骨和胫骨腔获取，使用α-MEM培养。细胞暴露于不同浓度的FAC（0–3200 μmol/L）48小时，CCK-8实验显示200 μmol/L FAC使细胞活力降低约40%，且呈剂量依赖性，故选择200 μmol/L作为实验浓度。使用三种sh-REPIN1慢病毒（LV-697、LV-1158、LV-1254）转染细胞，其中LV-697敲减效果最佳（GFP荧光强度大于90%，蛋白表达敲减至50%以下，基因表达敲减至30%以下），用于后续实验。慢病毒转染3天后使用含嘌呤霉素的培养基筛选稳定转染细胞系。
RNA测序与生信分析。 sh-REPIN1敲减的MC 3T3-E1细胞在200 μmol/L FAC中培养48小时后进行RNA测序（RNA-seq）。差异表达基因筛选标准为|fold change| > 2、p < 0.05且FDR < 0.05。共鉴定出1739个显著差异表达基因（1213个上调，526个下调），并通过KEGG通路富集分析探索相关信号通路。
LCN2功能验证。 使用siRNA敲减LCN2表达，以及pcDNA3.1/LCN2质粒过表达LCN2。转染效率通过荧光显微镜、Western blotting和qRT-PCR确认。通过TUNEL染色检测细胞凋亡，TMRE检测线粒体膜电位，FerroOrange荧光探针和普鲁士蓝染色检测细胞内铁含量。
REPIN1在骨质疏松中表达升高。 GEO数据库分析显示REPIN1在骨质疏松组表达升高（log FC = 6.33）。临床骨组织标本的Western blotting和qRT-PCR结果验证了这一发现，同时确认骨质疏松患者骨组织中存在铁蓄积。在铁过载小鼠模型的骨组织中也观察到REPIN1表达升高。体外实验中，BMSCs暴露于FAC后REPIN1蛋白水平呈剂量依赖性升高。普鲁士蓝染色和FerroOrange检测证实FAC处理后细胞内铁含量增加。
REPIN1敲减缓解铁过载对成骨功能的抑制。 普鲁士蓝染色显示sh-REPIN1组细胞中铁颗粒明显减少，FerroOrange结果与之吻合。活/死染色显示FAC增加了死细胞数量，而sh-REPIN1处理在一定程度上抵消了铁毒性。在成骨诱导条件下，ALP染色（7天）和ARS染色（21天）表明sh-REPIN1逆转了FAC对MC 3T3-E1细胞成骨分化的抑制。Western blotting和qRT-PCR结果均显示FAC干预后RUNX2、ALP、COL1A1和OSX等成骨标志蛋白表达下降，而sh-REPIN1处理挽救了这些表达。
REPIN1通过LCN2调控成骨细胞凋亡。 RNA-seq结果显示sh-REPIN1组中LCN2（lipocalin 2）的表达显著下降，同时BCL2和BAX的表达也发生显著变化。KEGG富集分析提示凋亡通路在此过程中发挥决定性作用。Western blotting和qRT-PCR证实sh-REPIN1组LCN2蛋白和mRNA表达均降低。临床标本检测也发现LCN2在骨质疏松患者中表达升高。TUNEL染色显示FAC处理增加了TUNEL阳性细胞数，而sh-REPIN1处理减少了凋亡细胞。Western blotting显示FAC组BCL2蛋白水平降低，Cyt c、BAX和cleaved caspase3水平升高，sh-REPIN1逆转了这一效应。线粒体膜电位检测结果与TUNEL结果一致。
改变LCN2表达可逆转或模拟sh-REPIN1的效应。 TUNEL染色显示，过表达LCN2（plasmid-LCN2）拮抗了sh-REPIN1对凋亡的挽救作用，而si-LCN2敲减LCN2则模拟了sh-REPIN1的抗凋亡效果。Western blotting和qRT-PCR结果进一步验证了这一点：plasmid-LCN2组中Cyt c、BAX和cleaved caspase3蛋白水平升高，BCL2降低；si-LCN2组与sh-REPIN1组蛋白表达水平相似。普鲁士蓝和FerroOrange染色证实改变LCN2表达可部分逆转或复制sh-REPIN1对细胞内铁代谢的调控作用。成骨标志蛋白的表达也呈现相应变化。
动物实验验证。 Micro-CT分析显示FAC组和NC+FAC组骨量减少，sh-REPIN1慢病毒治疗后骨丢失得到部分缓解。定量分析表明，与对照组相比，FAC组BMD、BV、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均降低，而BS/BV和Tb.Sp升高；REPIN1敲减后这些变化得以逆转。类似结果在OVX模型中亦得到证实。H&E染色显示sh-REPIN1治疗组骨小梁变薄明显改善。茜素红双标记实验显示FAC组两条标记线间距离显著缩短，sh-REPIN1组间距更宽，提示骨形成速率恢复。普鲁士蓝染色显示FAC组骨髓腔内大量蓝色铁颗粒，sh-REPIN1组显著减少。TUNEL染色表明sh-REPIN1缓解了体内凋亡。
本研究首次证明了REPIN1在铁代谢相关骨质疏松中的关键调控作用。铁过载通过影响铁代谢和凋亡抑制成骨细胞分化，这一过程可通过敲减REPIN1得以缓解。REPIN1通过调控LCN2的表达影响Cyt c、BAX和BCL2的水平，改变线粒体膜电位，进而通过线粒体凋亡通路发挥作用。研究结果基于临床标本、体内和体外实验的多重验证，为骨质疏松的通用治疗靶点探索提供了新思路。由于sh-REPIN1在FAC和OVX模型中均表现出治疗效果，提示REPIN1的调控具有普适性，对寻找多种类型骨质疏松的共同治疗靶点具有重要意义。
本研究的创新性体现在以下几个方面：第一，首次将REPIN1与铁代谢相关骨质疏松联系起来，通过GEO数据库分析、临床标本验证、体外实验和动物模型的系统研究，确立了REPIN1的关键调控作用。第二，通过RNA-seq发现了LCN2作为REPIN1下游靶基因参与铁代谢和凋亡调控，并通过siRNA和质粒的正反验证证实了LCN2的关键中介作用。第三，同时使用铁过载模型和OVX模型验证了REPIN1调控的普适性。第四，研究揭示了REPIN1-LCN2-线粒体凋亡通路的完整调控轴，为理解铁过载性骨质疏松的分子机制提供了新的理论框架。此外，LCN2作为分泌型糖蛋白，其血清水平可能与骨折风险相关，提示其可能作为骨质疏松的生物标志物和潜在治疗靶点。