蛋白质在冻融过程中聚集的解密：冷变性与剪切应力的作用

本研究由 Miguel Â. Rodrigues (通讯作者，来自 Smartfreez 公司及里斯本大学高等理工学院结构化学中心)， Andreia Duarte， Rafaela Neves， Vítor Geraldes (同属 Smartfreez 及结构化学中心)，以及 Klara Gries， Michael Schupfner， Sebastian Andris (来自德国勃林格殷格翰制药公司) 共同完成。研究论文《Deciphering protein aggregation in freeze-thaw process: the roles of cold denaturation and shear stress》发表于 European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 期刊的第 217 卷（2025年），在线发表日期为2025年10月25日。

学术背景 该研究属于生物制药制剂科学与蛋白质稳定性领域。冷冻与解冻（冻融）是生物制品（如单克隆抗体）在生产、储存和运输过程中的关键步骤，旨在延长药物物质的储存时间。然而，冻融过程本身会诱导蛋白质聚集（protein aggregation），形成聚集体，这可能引发免疫原性等安全问题，影响药品的安全性和有效性。因此，深入理解冻融诱导蛋白质聚集的机制，对于生物制药的早期处方开发和工艺优化至关重要。

冻融过程中，蛋白质面临多重压力。首先，水结晶导致未冻液相中的蛋白质、缓冲盐和辅料浓度急剧升高（即冷冻浓缩， freeze-concentration），在高浓度下易促进蛋白质自缔合。其次，局部温度和压力条件变化可能诱发冷变性（cold denaturation），即蛋白质在低温下发生去折叠。再者，冰晶生长会导致浓缩液相在冰的多孔结构中发生位移和渗透，从而产生界面应力和剪切应力（shear stress）。此外，冰晶生长方向（各向异性）会导致宏观的冷冻浓缩不均一（cryoconcentration）。这些应力可能协同作用，加剧蛋白质聚集。为了在工艺开发早期评估风险，常使用小规模模型（downscale model）来预测大规模生产中的稳定性问题。其中，“应力时间”（stress-time）是一个关键概念，指制剂在部分冻结状态下（即处于冰晶结构中、高度浓缩、且温度高于冷冻浓缩液的玻璃化转变温度 Tg‘）所经历的时间。研究团队认为，应力时间分布、冷变性温度区间以及冻结几何形状（影响剪切应力）是影响冻融聚集的关键变量，但它们在聚集机制中的相对贡献尚不完全清晰。

因此，本研究的核心目标是阐明在冻融应力时间内，导致蛋白质聚集的主要机制，特别是聚焦于冷变性和冰晶结构施加的剪切应力这两个方面。通过结合计算流体动力学（CFD, Computational Fluid Dynamics）模拟和精密的实验设计，旨在开发更准确的小规模模型，并加深对蛋白质冻融稳定性的理解。

详细研究流程 本研究是一项系统的实验与模拟相结合的研究，主要包括以下几个步骤：

1. 大规模容器（0.5升瓶）的基准研究与CFD建模 * 研究对象与处理：使用0.5升聚碳酸酯瓶，灌装0.4升模型溶液（19%牛血清白蛋白BSA，5%蔗糖）用于温度测绘，或灌装0.4升目标单克隆抗体（mAb，65 mg/mL）制剂用于聚集分析。将其置于程序控温箱中进行冻融循环。 * 实验方法：在瓶内外特定位置（如图1所示）布置热电偶，精确记录冻融过程中的温度-时间曲线。这为后续的CFD模拟提供了关键的边界条件验证数据。对于mAb样品，在特定实验中，在瓶口顶部安装了一种名为SmartfreezCryo Shield的隔热装置，旨在减缓顶部空气-液界面过早结冰，从而防止液体被冰壳封闭和内部压力积聚。 * CFD模拟开发与验证：研究团队使用其开发的SmartfreezSim计算云平台进行CFD模拟。模型基于Geraldes等人先前的工作，但采用了流体体积法（VOF）来计入顶空并允许生物混合物膨胀。该模型将冻结层视为多孔介质，考虑了纯水结晶导致的溶质浓缩、浓缩液相在冰孔隙中的自然对流和渗透（percolation）过程。关键创新之一是引入了基于Kozeny-Carman方程的阻力项来模拟冰基质对流动流体的拖曳力，并进一步推导出用于估算蛋白质在冰孔隙内壁所受剪切应力的公式（文中公式1-7）。通过将模拟温度曲线与实验测量的温度曲线进行匹配（图2），校准了模型的关键参数（如对流传热系数）。模拟输出了0.5升瓶在整个冻融过程中应力时间（包括冻结应力时间和解冻应力时间）的空间分布图（图3）以及累积质量百分比分布曲线。

2. 小规模模型（10毫升西林瓶）的构建与应力时间匹配 * 研究对象与设备：使用10毫升西林瓶，灌装5.5毫升相同的mAb制剂。冻融过程在Smartfreez提供的微缩规模（MSD）系统中进行。该系统能执行用户定义的复杂温度程序，精确控制冷却/加热速率，并能在瓶底实现可控的冰核化，促进自下而上（bottom-up）的单向冰生长几何形状。 * 实验与模拟结合的设计流程：目标是使小瓶复现0.5升瓶的应力时间分布。研究团队通过“试错法”进行CFD模拟，为西林瓶设计了一系列不同的冻结和解冻程序（表1列出了6种解冻方法，MSD_1至MSD_6）。CFD模拟用于预测每种程序下西林瓶内部的应力时间分布（图4），并与0.5升瓶的分布进行比较和匹配。通过控制MSD系统的升降温程序，将选定的模拟方案转化为实际的物理实验。此外，还通过拍照测量冰界面高度的方法，验证了CFD模拟预测冰生长/融化速率的准确性。

3. 蛋白质聚集分析与机制探究 * 样品处理与测试：将0.5升瓶（有/无隔热罩）和经过不同MSD程序处理的10毫升西林瓶中的mAb样品完成冻融循环（对于部分MSD实验进行了3个循环）后，进行解冻和分析。 * 分析技术：采用超高效体积排阻色谱（UP-SEC）定量分析样品中的单体损失和可溶性高分子量聚集体（HMWs）的含量（图5，图9）。 * 机制解析的关键设计： * 冷变性作用探究：为了区分应力时间中不同温度区间的作用，研究人员将总应力时间拆分为两个部分：TfT5（从冻结平衡温度Tf到-5°C的应力时间，此阶段接近等温，主要涉及界面和浓缩应力）和T5Tg‘（从-5°C到Tg‘的应力时间，此阶段温度变化较大，被认为是冷变性可能发生的关键区间）。通过比较不同MSD程序（具有不同TfT5和T5Tg‘组合）导致的聚集水平，来评估冷变性的重要性（图6，图7）。 * 剪切应力作用探究：通过对比0.5升瓶使用与不使用顶部隔热罩的实验结果，来评估因冰壳形成、液体封闭和压力积聚所导致的剪切应力的影响。隔热罩改变了冻结几何形状，使其更接近西林瓶的自下而上冻结，从而理论上减少了剪切应力（图10）。

4. 数据分析工作流 数据流高度整合：实验温度数据用于校准CFD模型 → CFD模型预测不同容器的应力时间分布、浓度分布和剪切应力分布 → 基于CFD预测设计小规模实验方案 → 执行实验并获得蛋白质聚集数据 → 将聚集数据与CFD提取的各类应力参数（总应力时间、TfT5、T5Tg‘、剪切应力、浓度梯度）进行关联分析，从而推断不同机制的贡献。

主要研究结果 1. 应力时间分布与尺度匹配：CFD模拟成功绘制了0.5升瓶内应力时间的非均匀空间分布（图3）。通过精心设计的MSD程序（特别是MSD_6方法），成功在10毫升西林瓶中复现了0.5升瓶的总解冻应力时间累积分布曲线和平均值（图4，表2）。然而，仅匹配总应力时间并不足以复现相同水平的聚集。

2. 冷变性的关键作用：当将解冻应力时间拆分为TfT5和T5Tg‘后，发现只有那些能使西林瓶的T5Tg‘（冷变性应力时间）与0.5升瓶处于相近范围的MSD程序（如MSD_3， MSD_4， MSD_6），才能产生与大规模容器相近的蛋白质聚集水平（图5，图7）。例如，MSD_6的T5Tg‘为150.57分钟，接近瓶子的103.57分钟，其单体损失约为瓶子的2/3。相反，即使总应力时间更长（如MSD_2），但T5Tg‘极短（18.51分钟）的程序，引起的聚集可忽略不计。这强烈表明，在-5°C至Tg‘温度区间内经历的时间（即冷变性相关应力）是驱动该特定单抗在冻融过程中聚集的关键变量。延长在较高温度（Tf至-5°C）下的应力时间并未显著增加聚集。

3. 剪切应力的贡献：对0.5升瓶的对比实验显示，使用顶部隔热罩后，蛋白质聚集减少了约20%（图9）。CFD模拟分析表明，使用与不使用隔热罩的冻结应力时间分布相似，但剪切应力分布显著不同（图10）。无隔热罩时，顶部形成冰壳并封闭液体，导致内部压力升高，迫使浓缩液相渗透过冰壳孔隙，产生局部高剪切应力区域（模拟值在1 N/m²量级，文献报道此量级剪切可诱导抗体聚集）。而有隔热罩或西林瓶的自下而上冻结方式避免了液体被完全封闭，从而减弱了这种剪切应力。这一结果证明剪切应力（源于冰界面渗透）也是冻融聚集的一个相关促进因素。

4. 小规模模型的性能与局限：最佳匹配的MSD程序（MSD_6）使西林瓶中的聚集水平达到了0.5升瓶的约2/3（而非100%）。这种差异归因于两个因素：一是西林瓶自下而上的冻结几何形状天然避免了大规模瓶中因顶部冰壳形成而产生的高剪切应力；二是CFD模拟显示，在解冻末期，瓶子中形成的浓度梯度（稀释效应）比西林瓶中更为显著（图8），这可能也影响了聚集的最终程度。

结论与价值 本研究得出以下核心结论： 1. 机制阐明：成功解析了冻融过程中蛋白质聚集的两个核心机制：在低温区间（-5°C至Tg‘）的停留时间（冷变性相关应力）是主要驱动因素；而由冰壳形成和液体渗透引起的剪切应力则作为重要的协同或促进因素（“更多是同谋而非元凶”）。 2. 模型价值：证实了通过CFD模拟辅助，精确控制热传递速率，可以使用5.5毫升（10毫升西林瓶）的小规模模型有效模拟体积大100倍（0.5升瓶）的冻融聚集行为。前提是模型必须能准确复现目标大规模容器在关键低温区间的应力时间（T5Tg‘）。 3. 策略意义：提供了一种系统的研究策略：不仅可用于作为特定工艺的风险评估工具（下规模模型），更能通过小规模系统的高表面积-体积比所提供的实验灵活性，主动探究不同变量（如冷变性、剪切）对聚集的影响，从而深化对生物制品冻融敏感性的根本理解。

研究的亮点 1. 创新性的多学科方法：将精密的实验控制（MSD系统）、先进的CFD建模（包含渗透和剪切应力估算）与蛋白质分析技术（UP-SEC）深度结合，形成了闭环的研究工作流。 2. 对“应力时间”概念的深化：创造性地区分了应力时间中的温度区间（TfT5 vs. T5Tg‘），并提供了实验证据，明确了冷变性相关时间窗口的关键性，这是对冻融应力量化理论的重要推进。 3. 机制的直接验证：通过对比“有/无顶部隔热罩”这一巧妙的实验设计，直接验证了冻结几何形状和由此产生的剪切应力对聚集的实际贡献，将长期假设的机制与实验数据关联起来。 4. 强大的预测与指导能力：所建立的CFD模型不仅用于描述现象，更用于主动设计实验（下规模程序），展示了计算工具在生物制药工艺开发中的实际应用价值。

其他有价值的内容 研究还涉及了CFD模型中对冰孔隙尺寸、配方热物理性质（粘度、密度随温度和浓度变化）的详细处理，这些细节保证了模拟的可靠性。同时，研究讨论了小规模模型在复现压力相关效应方面的局限性，并指出其他规模（如125毫升容器）可能在复现冰壳效应方面更具优势，这为不同目的的尺度缩小策略选择提供了参考。最后，研究强调了由局部高剪切产生的“热点”聚集体，虽然在整体聚集百分比中贡献小，但可能在后续储存或工艺步骤中成为更大的聚集体核，具有重要的实际意义。