《Nature Reviews Genetics》综述：Prime Editing——精准且高度灵活的基因组编辑技术
作者及发表信息
本文由Peter J. Chen和David R. Liu（来自哈佛大学、麻省理工学院Broad研究所及霍华德·休斯医学研究所）撰写，发表于2023年3月的《Nature Reviews Genetics》，系统总结了Prime Editing（PE，引物编辑）技术的原理、优势、局限性、优化策略及其应用前景。
学术背景
基因编辑技术（如CRISPR-Cas核酸酶、碱基编辑器Base Editors）已彻底改变了生命科学领域，但仍存在局限性：
1. CRISPR-Cas依赖DNA双链断裂（DSBs），易导致非靶向插入/缺失（indels）或染色体异常。
2. 碱基编辑（Base Editing）仅能实现部分单碱基转换（如C→T或A→G），无法完成所有12种可能的点突变或较大片段的插入/删除。
Prime Editing在此背景下应运而生，其核心优势在于：
- 无需DSBs，减少基因组不稳定性风险。
- 可精准实现任意单碱基替换、小片段插入或删除（理论上可达数百bp）。
- 编辑纯度（product purity）高，副产物（如indels）极少。
Prime Editing的核心机制
1. 基本组成
- Prime Editor（PE）蛋白：由Cas9切口酶（nCas9，仅切割单链）与逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）融合而成。
- Prime Editing Guide RNA（pegRNA）：包含两部分：
- 靶向序列（spacer）：引导PE结合目标DNA位点。
- 3’延伸模板：编码目标编辑序列（如突变、插入或删除）。
2. 编辑流程
- PE-pegRNA复合物结合目标DNA，nCas9在非互补链（non-complementary strand）切口。
- 切口处的3’端与pegRNA的引物结合位点（PBS）杂交，RT以pegRNA为模板合成含编辑序列的新DNA链。
- 细胞修复机制将编辑链整合入基因组：
- PE2系统：依赖内源性修复（效率较低，但副产物极少）。
- PE3系统：额外引入sgRNA切口非编辑链（提高效率，但可能增加indels）。
Prime Editing的优化策略
1. 提升编辑效率
- 蛋白工程：
- PE2*与PEmax：优化核定位信号（NLS）和RT稳定性（效率提升3倍）。
- ePPE（植物优化版）：移除RT的RNase H结构域，增强模板结合能力。
- pegRNA设计：
- epegRNA：在3’端添加抗降解结构（如EvopreQ1或MPknot），保护模板序列。
- 双pegRNA策略（如twinPE）：通过互补3’ DNA片段实现长片段（>100 bp）插入或删除。
2. 规避DNA修复障碍
- 抑制错配修复（MMR）：
- PE4/PE5：共表达显性负突变蛋白MLH1dn，使编辑效率提升7倍。
- 沉默突变设计：在目标编辑附近引入额外同义突变，逃逸MMR识别。
3. 扩展靶向范围
- Cas9变体：
- PE2-VQR/PE2-SpRY：识别非NGG PAM序列（如NGAN）。
- 小型化PE（如saCas9-PE）：便于病毒载体（如AAV）递送。
Prime Editing的应用
1. 疾病治疗
- 遗传病矫正：
- 成功修复导致镰刀型贫血（HBB E6V）、泰-萨克斯病（HEXA 4-bp插入）等突变。
- 在类器官模型中纠正囊性纤维化（CFTR）突变。
- 基因保护性编辑：如插入CCR5Δ32等位基因（抗HIV感染）。
2. 动物模型构建
- 在小鼠、斑马鱼胚胎中实现高效编辑（效率达47%），且副产物少于CRISPR-HDR。
3. 农业育种
- 在水稻、小麦中实现抗除草剂（OsACC1突变）和耐逆性编辑，但植物效率仍较低（<10%）。
技术挑战与未来方向
- 大片段插入（>1 kb）依赖重组酶（如Bxb1），需优化整合效率。
- 递送系统限制：AAV载体容量有限，需开发更高效的病毒或非病毒递送方法。
- 组织特异性编辑：目前肝、视网膜等器官编辑效果较好，其他组织（如神经、肌肉）仍需突破。
论文价值与亮点
- 全面性：系统梳理PE技术从原理到应用的全链条发展，包括最新优化策略（如epegRNA、twinPE）。
- 创新性：提出“规避MMR”和“双pegRNA协同编辑”等突破性思路。
- 跨学科指导意义：为基因治疗、农业育种、功能基因组学提供通用工具。
这篇综述不仅是PE技术的里程碑式总结，更为未来精准医学和合成生物学奠定了方法论基础。