纳米孔测序技术及其在基础与应用研究中的应用：技术发展、生物信息学方法与前沿进展综述
作者及发表信息
本文由Yunhao Wang、Yue Zhao、Audrey Bollas等（美国俄亥俄州立大学生物医学信息学系）共同撰写，于2021年11月发表于《Nature Biotechnology》，题为《Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications》。
本文是一篇系统性综述，聚焦Oxford Nanopore Technologies (ONT)开发的纳米孔测序技术自2014年首款设备MinION发布以来的快速发展。纳米孔测序利用生物蛋白质纳米孔作为传感器，通过测量单链DNA/RNA分子穿膜时的电流变化实现实时单分子测序。文章全面梳理了该技术在准确性、读长、通量方面的突破，生物信息学分析方法的创新，以及其在基因组学、转录组学、表观遗传学和临床诊断等领域的广泛应用。
核心观点：纳米孔测序的核心是通过纳米孔蛋白（如α-hemolysin或工程化的CsgG）结合马达蛋白（如phi29 DNA聚合酶），控制核酸分子逐步穿过纳米孔，电流信号变化对应核苷酸序列。
技术演进：
- 纳米孔设计：从早期α-hemolysin（1.4–2.4 nm孔径）到工程化的CsgG（提升信号稳定性），再到R10版本的双传感区设计（改善同聚物测序准确性）。
- 读长与通量：通过高分子量DNA提取技术（如磁珠筛选、琼脂糖凝胶电泳），最大读长从2017年的800 kb提升至2018年的2.273 Mb；通量从MinION的数百Mb/流式细胞增至PromethION的153 Gb/流式细胞。
- 直接RNA测序：通过适配体连接原生RNA实现直接测序，无需逆转录，但平均准确度较低（83–86%）。
支持证据：
- 引用独立研究数据（如R9.4纳米孔读速450 bases/s；R10.3双传感区设计可区分5mC修饰（5-甲基胞嘧啶））[37]。
核心观点：纳米孔数据的高错误率（6–15%）和长读长特性需针对性开发算法，涵盖碱基识别（base calling）、错误校正和基因组组装等。
关键方法：
- 碱基识别：从早期隐马尔可夫模型（HMM）发展为深度学习模型（如Guppy采用的循环神经网络和Flip-flop模型），准确率从65%（R7）提升至94%（R9.4）。
- 错误校正：分为“自我校正”（如Canu通过重叠一致序列）和“混合校正”（如FMLRC利用短读长数据），可将错误率降至1–4%。
- 表观修饰检测：通过电流信号差异识别DNA甲基化（5mC、6mA）和RNA修饰（m6A），工具如Nanopolish、Tombo。
支持证据：
- 基准测试显示Guppy在单核苷酸分辨率下检测5mC的准确性优于PacBio[75]。
核心观点：纳米孔测序在基因组组装、临床诊断和实时监测等领域展现出独特优势。
应用案例：
- 基因组组装：完成人类X染色体端粒到端粒（T2T）无缝组装，填补1.1 Mb缺口[134]；用于非模式生物（如科莫多龙、小麦）基因组解析。
- 传染病监测：2015年埃博拉疫情中，MinION在几内亚实现实时测序（15–60分钟/样本）[220]；COVID-19疫情期间用于病毒基因组追踪[152]。
- 癌症基因组学：单日流程检测脑肿瘤样本的拷贝数变异和5mC修饰，加速分子诊断[193]。
支持证据：
- 引用ONT直接RNA测序验证SARS-CoV-2基因组[153]，与传统方法相比节省时间。
核心观点：技术仍面临错误率高、样本需求量大的挑战，需通过纳米孔工程、算法优化和实验流程改进解决。
未来方向：
- 提高准确性：探索非生物纳米孔（如石墨烯孔）以实现单核苷酸分辨率信号[240]。
- 单分子多组学：结合染色质可及性（如SMAC-seq[175]）和RNA二级结构分析（如Pore-Cupine[184]），研究单分子表观异质性。
- 自动化与便携性：开发集成样本制备-测序-分析的端到端系统，推动现场应用（如太空站、冰川监测[237]）。
本文系统总结了纳米孔测序的技术发展、分析工具和应用场景，为研究者提供了以下价值：
1. 技术参考：详述从纳米孔设计到数据优化的全流程，指导实验方法选择。
2. 跨学科应用：涵盖基础研究（如端粒组装）到临床（如快速病原检测）的广泛场景，突显其“长读长、实时性、便携性”三大优势。
3. 前沿展望：指出单分子表观遗传学和低成本个性化基因组学的潜力，推动技术边界扩展。
亮点：
- 技术创新：R10双传感区、直接RNA测序等突破性设计。
- 多领域整合：首次将纳米孔测序与表观遗传学、传染病监测等结合，展示技术通用性。
- 开源工具生态：列举40余种生物信息学工具（如Minimap2、Sniffles），促进社区协作。