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酪氨酸及神经递质的高灵敏度检测：立体选择性生物合成与光化学诱导动态核极化技术的结合

作者及发表信息

本研究由Ummay Mahfuza Shapla、Jamorious L. Smith（共同第一作者）、Anubhab Halder、Lillian Thompson、Andrew R. Buller*（通讯作者）和Silvia Cavagnero*（通讯作者）合作完成，发表于Journal of the American Chemical Society（JACS），DOI编号为10.1021/jacs.5c11334。

学术背景

酪氨酸（Tyrosine, Tyr）是蛋白质的关键组成单元，也是多巴胺、肾上腺素等神经递质的前体分子。然而，传统技术（如质谱、HPLC）在检测Tyr及其代谢物时存在灵敏度低、分辨率不足等问题，阻碍了苯丙酮尿症、酪氨酸羟化酶缺乏症等疾病的诊断。本研究旨在开发一种基于光化学诱导动态核极化（photochemically induced dynamic nuclear polarization, Photo-CIDNP）的超灵敏核磁共振（NMR）技术，结合准孤立自旋对（quasi-isolated spin pair, QISP）标记策略，实现Tyr及其代谢物的原子级分辨率检测。

研究流程与实验方法

1. QISP-Tyr的化学酶法合成

   • 设计思路：通过酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol lyase, TPL）催化逆向反应，以氘代酚和氘代丙酮酸为底物，合成氘代Tyr（Tyr-d3）；随后利用PLP依赖性脱氘酶（DSAD）选择性去除Cα位氘原子，生成QISP-Tyr（含1Hα−13Cα自旋对）。
     
   • 关键步骤：
     
     • 底物氘代：丙酮酸在pD 8.5条件下通过H/D交换实现全氘代（pyruvate-d3）。
       
     • 酶反应优化：以Citrobacter freundii来源的TPL（CfTPL）为核心酶，在D2O缓冲体系中反应，避免质子干扰。
       
     • NMR验证：通过1H和13C NMR确认QISP-Tyr的1Hα信号（3.91 ppm）及13Cα双峰（56.19 ppm）。
       

2. 低浓度光化学诱导动态核极化（LC-Photo-CIDNP）技术开发

   • 超极化原理：利用荧光素（fluorescein）或Attothio 12染料的光激发三重态与Tyr自由基的电子转移，增强13C−1H自旋对的核极化信号。
     
   • 实验优化：
     
     • 磁场依赖性：在14.1 T（600 MHz）和1.88 T（80 MHz）谱仪上对比，发现低磁场下QISP-Tyr的极化增强因子（ε）达313，显著优于均匀标记Tyr（~30）。
       
     • 染料筛选：Attothio 12对Tyr的灵敏度提升16.9倍，优于荧光素（7.2倍）。
       

3. 复杂生物介质中的检测验证

   • 细胞提取物测试：将10 μM QISP-Tyr加入大肠杆菌细胞提取物，通过13C RASPRINT脉冲序列（选择性检测13C−1H对）消除背景干扰，在9分钟内实现检测。
     
   • 天然丰度代谢物检测：肾上腺素（epinephrine）在10 nM浓度（1.3纳克）下仍可被检出，创下溶液NMR最低检测记录；Tyr和L-多巴（L-dopa）的检测限分别为200 nM和500 nM。
     

主要结果与逻辑关联

• 合成效率：QISP-Tyr的产率>95%，且模块化合成路线可扩展至其他同位素标记变体（如13Cα选择性标记Tyr）。
  
• 灵敏度优势：QISP-Tyr的LC-Photo-CIDNP信号强度比天然丰度Tyr高10.7倍（Attothio 12染料），归因于：
  
  • 暗效应：减少J耦合导致的磁化损失及更长的1Hα横向弛豫时间（T2）。
    
  • 光效应：低磁场下13Cα的geminate极化增强（计算预测支持）。
    
• 应用验证：在细胞提取物中，QISP-Tyr的检测不受数千种内源分子干扰，证明其生物相容性。
  

结论与价值

1. 科学价值：
   
   • 首次将QISP标记与LC-Photo-CIDNP结合，实现了Tyr及其代谢物的超灵敏（纳摩尔级）、原子分辨率检测。
     
   • 揭示了低磁场对QISP极化增强的独特作用，为低成本台式NMR应用奠定基础。
     
2. 应用潜力：
   
   • 疾病诊断：无需样品预处理即可检测病理浓度下的Tyr代谢异常（如苯丙酮尿症）。
     
   • 代谢研究：实时追踪神经递质动态，推动脑科学及药物开发。
     

研究亮点

• 方法创新：开发了QISP-Tyr的模块化生物合成路径，克服了传统同位素标记的成本与复杂性限制。
  
• 技术突破：LC-Photo-CIDNP将肾上腺素检测限推进至10 nM，为溶液NMR树立新标杆。
  
• 跨学科融合：结合酶工程、光化学与核磁共振，展示了多学科协同解决生物分析难题的范例。
  

其他价值

研究还提出Photo-CIDNP技术与代谢组学、临床便携式NMR的结合前景，未来可拓展至其他芳香族分子的原位检测。

这篇报告全面覆盖了研究的背景、方法、结果与意义，突出了其技术突破与跨学科价值，适合面向科研同行进行学术交流。