LAMP1通过促进在弱酸性内体区室中的融合提高拉沙病毒感染效率
主要作者与发表信息
本文作者为Christine E. Hulseberg、Lucie Fénéant、Katarzyna M. Szymańska和Judith M. White，分别来自弗吉尼亚大学微生物学系和细胞生物学系。该研究于2018年1月2日发表在mBio期刊上。
学术背景
拉沙病毒（Lassa virus, LASV）是沙粒病毒科（Arenaviridae）中临床意义最重要的成员。该病毒通过啮齿动物排泄物吸入或摄入污染食物和水感染人类，可引起拉沙热。沙粒病毒科目前包括七种公认的出血热病毒，其中拉沙病毒属于旧世界沙粒病毒。淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）作为旧世界沙粒病毒的原型，是研究最为深入的病毒之一。
与其他旧世界沙粒病毒一样，拉沙病毒颗粒利用其表面的三聚体糖蛋白刺突与主要细胞表面受体α-抗肌萎缩相关糖蛋白（α-dystroglycan, α-DG）结合。结合后，病毒颗粒被内化进入内吞途径。随着内体成熟和酸化，低pH环境最终触发病毒膜与内体膜之间的融合，使病毒基因组通过融合孔释放到细胞质中。这一膜融合事件由病毒糖蛋白复合物（glycoprotein complex, GPC）介导，该复合物由受体结合亚基GP1、融合性跨膜亚基GP2和稳定信号肽组成。随着内体pH降低，GP1从复合物上解离，触发GP2发生重大构象重排，暴露驱动膜融合的疏水性融合环。
拉沙病毒的一个独特特征是其采用第二受体——细胞内受体。在内吞途径中，GP1亚基经历pH依赖性转换，从细胞表面的α-DG受体切换至内体受体LAMP1（lysosomal-associated membrane protein 1，溶酶体相关膜蛋白1）。拉沙病毒GP1与LAMP1的配对是病毒利用细胞内受体的第二个例子，第一个是埃博拉病毒GP1利用尼曼-匹克C1（Niemann-Pick C1, NPC1）蛋白。尽管这些相互作用已被充分记录，但LAMP1和NPC1促进病毒进入的精确机制仍不清楚。
本研究旨在探索LAMP1在拉沙病毒融合和进入中的作用。具体而言，研究者希望阐明LAMP1如何促进拉沙病毒感染，以及这一过程发生的具体内体区室。
详细研究流程
本研究包含多个实验程序。首先，研究者使用编码短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）的慢病毒在293T细胞中建立了LAMP1敲低（knockdown, KD）细胞系。该敲低使LAMP1表达降低至野生型水平的约15%。随后，研究者使用CRISPR/Cas9基因编辑技术生成了LAMP1敲除（knockout, KO）细胞系。通过有限稀释和荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）获得单克隆细胞系，并利用Western blotting和细胞内Western（in-cell western, ICW）分析验证LAMP1表达的缺失。最终选取八个克隆进行筛选，其中三个克隆（显示不可检测的LAMP1水平）被用于后续实验。
在感染效率评估方面，研究者使用了两种不同的假病毒系统：基于鼠白血病病毒（murine leukemia virus, MLV）核心的假病毒和基于水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）核心的假病毒。MLV假病毒携带萤光素酶报告基因或Gag-β-内酰胺酶（β-lactamase, βlam）嵌合蛋白，后者在进入细胞质后切割CCF2-AM底物，产生从绿色到蓝色的荧光变化，作为病毒进入的灵敏读数。VSV假病毒携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）报告基因。所有假病毒均表达拉沙病毒GPC或LCMV GPC作为包膜糖蛋白。
在融合实验中，研究者采用了高度灵敏的分裂萤光素酶细胞-细胞融合测定法。效应细胞（表达LASV或LCMV GPC的293T细胞）表达分裂萤光素酶/GFP构建体的一半，与表达另一半构建体并具有不同LAMP1表面水平的靶细胞共培养。共培养物暴露于特定pH缓冲液后重新中和，1小时后检测萤光素酶活性。靶细胞包括野生型、LAMP1敲低、LAMP1敲除以及瞬时过表达质膜定向LAMP1（plasma membrane-directed LAMP1, pmLAMP1）的细胞。pmLAMP1细胞表面LAMP1表达量至少比野生型高20倍。
此外，研究者还进行了强制质膜融合实验。将携带萤光素酶报告基因的LASV GPC VSV假病毒与野生型或表达pmLAMP1的COS-7细胞在低温下结合，然后短暂暴露于不同pH缓冲液以触发融合，重新中和后加入氯化铵（NH₄Cl）抑制内体酸化从而阻断内吞途径的自然进入。24小时后通过海肾萤光素酶活性与萤火虫萤光素酶活性的比值评估病毒与质膜的融合。为确定LAMP1是否促进拉沙病毒在弱酸性内体中进入，研究者用不同浓度的NH₄Cl逐步提高内体pH，并比较野生型和LAMP1敲除细胞中拉沙病毒GPC介导的假病毒感染对NH₄Cl的敏感性差异。
主要研究结果
在第一组实验中，研究者发现LAMP1敲低细胞与野生型细胞对所有测试的拉沙病毒假病毒输入量均表现出同等的感染易感性。LCMV GPC假病毒感染不受LAMP1表达降低的影响，这与LCMV不与LAMP1相互作用的已知事实一致。这一结果表明，在293T细胞中约15%的残留LAMP1表达足以完全支持高效的拉沙病毒GPC介导的感染。
在敲除实验中，八个LAMP1 KO克隆的拉沙病毒MLV假病毒感染效率降低至野生型的约20%。LCMV MLV假病毒在KO细胞系中的感染性与亲本野生型细胞相当。三个LAMP1表达不可检测的KO克隆在多重假病毒输入范围内均显示约15%至30%的野生型感染水平。使用VSV假病毒系统获得了相似结果：拉沙病毒VSV假病毒感染LAMP1 KO细胞的效率为野生型的15%至30%，而LCMV VSV假病毒感染KO细胞与野生型细胞同样高效。
使用MLV-Gag-βlam假病毒的进入实验进一步证实，拉沙病毒GPC介导的进入在LAMP1 KO细胞中发生在野生型水平的约25%至35%，而LCMV GPC假病毒的进入在野生型和KO细胞中大致相同。
在细胞-细胞融合实验中，拉沙病毒GPC介导的融合效率差异在pH 6以下变得明显，与pmLAMP1细胞的融合比野生型细胞高1至2个对数单位。将各pH值的融合活性标准化至pH 4.5的活性后，观察到pmLAMP1细胞存在显著的上移融合pH依赖性。例如，野生型细胞在pH 5.0时的融合约为pH 4.5时的20%，而pmLAMP1细胞在相同pH下的融合与pH 4.5时相似。即使在pH 5.5，pmLAMP1细胞仍有可观的融合（约pH 4.5时的40%），而野生型细胞仅显示背景水平的融合。LCMV GPC介导的融合在野生型和pmLAMP1细胞之间既未增加融合程度，也未改变融合pH阈值。
强制质膜融合实验显示，在缺乏pmLAMP1的情况下，pH 5.0和5.5时观察到低水平的融合；而在pmLAMP1细胞中，pH 5.0和5.5时观察到强烈的融合信号。
在NH₄Cl敏感性实验中，LAMP1 KO细胞中的拉沙病毒感染确实比野生型细胞对NH₄Cl的中和效应更敏感。相应地，需要更高浓度的NH₄Cl才能阻断野生型细胞中拉沙病毒GPC介导的感染。LCMV感染在野生型和LAMP1 KO细胞之间未显示NH₄Cl敏感性差异。八点剂量反应曲线和抑制浓度的确定进一步支持了这一发现：拉沙病毒在野生型和KO细胞之间的抑制浓度差异显著大于LCMV。
结论与意义
本研究证明LAMP1在拉沙病毒进入中发挥重要但非绝对必需的作用。具体而言：首先，约85%的LAMP1表达降低不影响拉沙病毒假病毒感染293T细胞的效率。其次，LAMP1敲除虽降低但并未消除拉沙病毒的进入和感染。第三，LAMP1显著提高了拉沙病毒GPC介导融合的pH阈值，从异常低的pH 4.5最适值提升至pH 5.0至5.5的更生理范围。第四，拉沙病毒在含有LAMP1的细胞中通过弱酸性内体进入，而在缺乏LAMP1的细胞中则需运输至更酸性的内体。
研究者提出，通过提高融合的pH阈值，LAMP1使拉沙病毒颗粒能够在遇到日益酸性和严酷的蛋白水解环境之前退出内吞途径，从而避免大量进入病毒被灭活。这一机制解释了LAMP1如何提高拉沙病毒进入和感染的整体效率。
该研究的科学价值在于阐明了LAMP1作为细胞内受体促进拉沙病毒进入的机制，这是继埃博拉病毒利用NPC1之后病毒利用细胞内受体的第二个例子。从应用价值而言，拉沙热缺乏特异性抗病毒疗法，识别可药物靶向的靶点具有迫切需求。阻断病毒进入阶段的干预措施尤为有吸引力，本研究揭示的LAMP1介导融合机制为开发靶向拉沙病毒进入的抑制剂提供了理论基础。
研究亮点
本研究的亮点包括：系统性地比较了LAMP1敲低和敲除对拉沙病毒感染的影响，明确了LAMP1的非绝对必需性；通过多种实验方法（包括细胞-细胞融合、假病毒-细胞表面融合和NH₄Cl敏感性分析）一致地证明了LAMP1提高融合pH阈值的作用；提出了LAMP1通过允许病毒在弱酸性内体中融合从而避开晚期内体/溶酶体严酷环境的机制模型；以及发现LCMV可能不依赖内体受体辅助融合，提示不同旧世界沙粒病毒在进入机制上可能存在差异。
此外，研究还提出了未来值得探索的问题，包括CD63是否能在缺乏LAMP1的细胞中部分支持拉沙病毒进入，以及LCMV GPC是否能够更好地耐受更酸性内体中的严酷条件从而无需内体受体辅助即可进行低pH依赖性融合激活。