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突尼斯海产品及沉积物中三种主要致病性弧菌的分子检测

期刊:Journal of Food ProtectionDOI:10.4315/0362-028x.jfp-16-205

突尼斯海产品及沉积物中三种主要致病性弧菌的分子检测研究

作者及机构
本研究由Morsi Gdoura(突尼斯斯法克斯大学环境毒理学与微生物学健康研究单元UR11ES70)、Hanen Sellami等来自突尼斯、法国多家机构的学者合作完成,发表于Journal of Food Protection 2016年12月第79卷第12期(DOI:10.43150362-028X.JFP-16-205)。

学术背景
弧菌属(*Vibrio*)是全球范围内水产品相关疾病的主要病原体,尤其在温暖沿海地区,副溶血性弧菌(*V. parahaemolyticus*)、霍乱弧菌(*V. cholerae*)和创伤弧菌(*V. vulnificus*)对人类健康构成严重威胁。近年来,产毒基因(如*toxR*)阳性的溶藻弧菌(*V. alginolyticus*)也被发现与食源性疾病相关。突尼斯作为地中海沿岸国家,其海产品消费量高,但缺乏对弧菌污染的系统性监测。传统培养方法(如ISO/TS 21872-1)耗时长且灵敏度有限,而分子检测技术(如实时荧光定量PCR)可弥补这一缺陷。本研究旨在开发一种高效、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测突尼斯海产品及环境中三种主要致病性弧菌,并评估其污染现状。

研究流程
1. 样本采集与处理
- 样本类型与数量:共247份样本,包括113份鱼类(涉及*Labrus viridis*等13种)、83份蛤类(*Ruditapes decussatus*)、30份海水和21份沉积物,采集自突尼斯南部(斯法克斯、杰尔巴、加贝斯)和北部(比塞大)的渔港及贝类养殖区(2012年8月至10月及2014年7月至11月)。
- 预处理:鱼类和蛤类样本经均质化后,用含2% NaCl的碱性蛋白胨水(APW)在41°C预富集6小时;海水和沉积物通过过滤或离心浓缩细菌。

  1. 传统培养与生化鉴定

    • 分离培养:使用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂(TCBS)筛选弧菌,绿色(非蔗糖发酵)和黄色(蔗糖发酵)菌落进一步纯化。
    • 生化测试:通过API 20E系统、氧化发酵试验(ZOF培养基)和盐耐受性试验(0.6%-8% NaCl)鉴定菌种。结果显示102份样本(41.3%)为弧菌阳性,其中溶藻弧菌占比最高(82株),副溶血性弧菌次之,霍乱弧菌未被分离到。
  2. 分子检测方法开发

    • 引物与探针设计:针对*V. parahaemolyticus*的*pr72h*基因(磷酸酯酶合成酶基因)、*V. alginolyticus*的*gyrB*基因(DNA旋转酶B亚基)和*V. cholerae*的*toxR*基因(跨膜转录激活基因)设计特异性引物和TaqMan探针(表2)。
    • 特异性验证:测试32种非弧菌菌株(如沙门氏菌、大肠杆菌)均无交叉反应,5株副溶血性弧菌、4株溶藻弧菌和2株霍乱弧菌标准株均显示特异性扩增。
    • 灵敏度测试:对纯培养菌的检测限低至1 CFU/PCR反应,标准曲线线性回归系数(R²)均>0.98(图2)。
  3. 实时荧光定量PCR检测

    • 样本检测:126份样本(51%)呈弧菌阳性,其中溶藻弧菌占78.57%(99份),副溶血性弧菌占20.63%(26份),霍乱弧菌仅1份(0.7%)。值得注意的是,24份培养阴性样本通过PCR检出阳性,表明传统方法存在漏检。

主要结果
1. 污染分布:蛤类(51.8%)和鱼类(43.4%)的弧菌检出率显著高于海水(10%)和沉积物(33.3%),证实海产品是弧菌传播的重要载体。
2. 方法对比:实时荧光定量PCR的检出率(51%)高于传统培养法(41.3%),且能识别培养法漏检的样本(如霍乱弧菌)。
3. 物种差异:溶藻弧菌为优势种,尤其在蛤类(85.7%阳性)和鱼类(74.6%阳性)中;副溶血性弧菌在海水样本中占比达10%。

结论与价值
1. 科学价值:本研究首次在突尼斯建立了针对三种致病性弧菌的多重实时荧光定量PCR检测体系,其高灵敏度和特异性为环境及食品监测提供了可靠工具。
2. 应用价值:突尼斯零售海产品中弧菌污染普遍,尤其是溶藻弧菌和副溶血性弧菌,提示需加强生食海产品的卫生监管。
3. 技术革新:通过靶向保守基因(如*gyrB*、*toxR*)和功能基因(如*pr72h*),解决了传统生化鉴定难以区分近缘物种(如副溶血性弧菌与溶藻弧菌)的问题。

研究亮点
1. 多靶点检测:首次整合*pr72h*、*gyrB*和*toxR*基因,实现单次反应中三种弧菌的同步鉴别。
2. 环境关联性:揭示了海水和沉积物作为弧菌自然储源与海产品污染的直接关联。
3. 公共卫生意义:为热带/亚热带地区食源性弧菌病的防控提供了数据支持和技术范本。

其他发现
- TCBS培养基对霍乱弧菌环境株的分离效率低,印证了Hoi等(1998)的结论,建议结合分子方法以提高检出率。
- 溶藻弧菌的高流行可能与突尼斯沿海水温升高有关,需进一步研究其毒力基因(如*toxRS*)的分布。

(注:文中涉及的基因名称如*pr72h*、*gyrB*等保留原文,技术术语如“实时荧光定量PCR(real-time PCR)”在首次出现时标注英文。)

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