关于GSDME依赖性细胞焦亡通过促进血管衰老驱动腹主动脉瘤的研究报告
一、 研究团队与发表信息
本研究的主要作者包括孙思佳、张震、张国艳、吴建进、张益鑫、吴文斌、张妍、殷航、张建斌、曹奇、吴静雯、沈甫明、周建、李东杰和王培。研究团队主要来自同济大学医学院附属第十人民医院药学部、海军军医大学（第二军医大学）长征医院血管与腔内血管外科、海军军医大学药理学教研室以及同济大学医学院附属第十人民医院心脏外科。该研究成果于2025年发表在*Nature Communications*期刊上。
二、 学术背景与研究目标
本研究属于心血管疾病与细胞生物学交叉领域，聚焦于腹主动脉瘤的发病机制。腹主动脉瘤是一种以主动脉进行性扩张为特征的严重心血管疾病，破裂后死亡率极高。目前，手术修复仍是唯一的治疗手段，缺乏有效的药物干预方案，因此深入理解其分子机制至关重要。
细胞衰老（Senescence）被认为是AAA病理的关键因素之一。衰老细胞会分泌一系列有害物质，称为衰老相关分泌表型，这些物质可引发慢性炎症和免疫系统激活，损害邻近细胞。血管平滑肌细胞是血管结构和功能的核心，其衰老与血管功能下降密切相关。然而，AAA中衰老的调控机制尚不清楚。
另一方面，细胞焦亡（Pyroptosis）是一种新近被认识的程序性细胞死亡方式，由gasdermin家族蛋白介导。其中，GSDME（gasdermin E）因其独特的激活方式而备受关注：它通常被凋亡相关的caspase-3切割，从而将非炎症性的凋亡转变为炎症性的焦亡，因此被视为细胞死亡模式（凋亡与焦亡）的“开关”。此前研究提示焦亡在AAA中可能有害，但GSDME在AAA中的具体作用、调控模式和细胞特异性尚属未知。
基于此，本研究旨在探究GSDME依赖性非经典细胞焦亡在AAA中的作用。核心科学问题是：GSDME是否以及如何通过诱导血管平滑肌细胞衰老来驱动AAA的进展？其研究目标包括：1）确认GSDME在AAA患者和模型小鼠病变血管壁中的激活状态；2）阐明GSDME缺失对AAA发展和血管衰老的影响；3）利用多组学技术解析GSDME影响的具体细胞类型（特别是VSMCs）和免疫状态转变；4）通过细胞特异性回补实验验证GSDME在VSMCs中的关键作用；5）探索靶向衰老细胞（senolytic therapy）对GSDME驱动的AAA的治疗潜力。
三、 详细研究流程
本研究设计严谨，整合了临床样本分析、多种小鼠模型、体外细胞实验以及高通量测序技术，流程环环相扣。
流程一：临床与动物模型中GSDME激活的确认 * 研究对象与样本量：收集了10例AAA患者的手术样本和10例对照（正常）主动脉样本。建立了两种小鼠AAA模型：1）猪胰弹性蛋白酶灌注联合β-氨基丙腈单富马酸盐（BAPN）饮水诱导的模型；2）载脂蛋白E敲除小鼠输注血管紧张素II诱导的模型。 * 实验方法与处理：对人和小鼠的主动脉组织进行蛋白质印迹、免疫荧光染色和qPCR分析，检测全长GSDME及其被切割的N端片段、caspase-3的活化以及炎症因子水平。利用公共基因表达数据集（GSE47472）分析gasdermin家族成员在AAA中的表达谱。通过单细胞RNA测序公共数据集（GSE239620）分析GSDME和GSDMD在不同细胞类型中的表达模式。 * 数据分析：比较病变组织与正常组织中GSDME的激活水平，分析其与动脉瘤直径、炎症、纤维化等病理指标的相关性。
流程二：GSDME全局敲除对AAA病理的影响 * 研究对象：构建了GSDME全局敲除小鼠，并将其与上述两种AAA模型结合。 * 实验方法与处理：评估敲除小鼠与野生型小鼠在AAA模型中的生存率、主动脉最大直径（超声监测）、主动脉重量、血管壁结构（H&E和EVG染色）、弹性纤维完整性、基质金属蛋白酶表达以及细胞死亡情况（流式细胞术检测SYTOX阳性细胞）。 * 数据分析：系统比较GSDME敲除后，AAA的严重程度、血管结构破坏、细胞外基质降解和细胞死亡是否得到缓解。
流程三：GSDME对血管免疫细胞浸润和炎症状态的影响 * 研究对象：从AAA模型小鼠的病变血管壁分离CD45+白细胞。 * 实验方法与处理：采用多重流式细胞术，结合t-SNE非线性降维分析和手动设门策略，对巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞进行高维表型分析。使用特定抗体标记（如CD11b, Ly6G, F4/80, Tim4, MHCII, Ly6C）来区分不同功能亚群（如促炎的Ly6C高单核细胞、抗炎的Ly6C低单核细胞、抗原呈递的MHCII+巨噬细胞、组织定居的Tim4+巨噬细胞等）。同时进行免疫荧光染色验证巨噬细胞浸润。 * 数据分析：定量比较GSDME敲除后，病变血管壁中各类免疫细胞亚群的比例变化，明确GSDME对免疫微环境的重编程作用。
流程四：GSDME对血管衰老的调控作用 * 研究对象：AAA小鼠病变血管组织及原代培养的小鼠和人源VSMCs。 * 实验方法与处理： * *体内*：对主动脉组织进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色，检测衰老标志蛋白（p21, p53, p16, γH2A.X）的表达，并通过qPCR和ELISA分析SASP因子（如IL-1β, IL-6, CXCL1, CCL2）和损伤相关分子模式（如HMGB1）的水平。 * *体外*：用Ang II联合博来霉素处理原代VSMCs，模拟衰老诱导条件。检测GSDME切割的时间点、炎症因子释放以及衰老标志物的表达。比较来自野生型和GSDME敲除小鼠的VSMCs在相同刺激下的衰老表型差异。 * 数据分析：确定GSDME激活与血管衰老在时间和空间上的关联，并验证GSDME缺失对VSMCs衰老的抑制作用。
流程五：多组学转录谱分析揭示GSDME缺失的全局影响 * 研究对象：来自野生型和GSDME敲除AAA小鼠的病变血管组织。 * 实验方法与处理： * *批量RNA测序*：对组织进行整体转录组分析。 * *单细胞RNA测序*：制备血管壁单细胞悬液，进行10x Genomics平台测序，获得14，393个细胞的转录组数据。 * 数据分析： * *批量RNA-seq*：进行差异表达基因分析、功能富集分析（GO、KEGG），比较敲除组与野生组在免疫反应、细胞衰老、细胞外基质组织等通路上的差异。 * *单细胞RNA-seq*：进行细胞聚类和注释，识别VSMCs、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等主要细胞类型。使用基因集变异分析（GSVA）比较不同基因集在特定细胞簇中的活性变化。利用CellChat软件包构建细胞间通讯网络，分析信号通路（特别是SASP相关通路）的强度变化。对VSMCs和髓系细胞进行亚群细分和拟时序分析，描绘细胞状态转变轨迹。
流程六：细胞特异性回补实验验证GSDME在VSMCs中的关键作用 * 研究对象：构建了两种组织特异性回补GSDME的小鼠模型：1）在平滑肌细胞中特异性回补GSDME的小鼠（Gsdme^stop/stop; SMMHC-CreERT2，简称Gsdme^SR）；2）在髓系细胞中特异性回补GSDME的小鼠（Gsdme^stop/stop; LysM-Cre，简称Gsdme^MR）。以Gsdme^wt/wt和Gsdme^stop/stop小鼠作为对照。 * 实验方法与处理：在所有基因型小鼠中诱导AAA模型，评估其生存率、主动脉扩张、血管结构、衰老标志及SASP因子表达。 * 数据分析：明确仅在VSMCs中回补GSDME是否能重现AAA表型和血管衰老，从而锁定GSDME发挥作用的关键细胞类型。
流程七：Senolytic疗法对GSDME依赖性AAA的干预效果 * 研究对象：Gsdme^SR和Gsdme^stop/stop AAA小鼠。 * 实验方法与处理：给予senolytic药物组合达沙替尼+槲皮素治疗。评估治疗后血管衰老标志物（SA-β-gal， p16， p21）、SASP因子、动脉瘤直径、主动脉重量、血管结构（EVG染色）和基质降解蛋白（MMP2， CCL2）的变化。同时检测药物是否影响GSDME本身的切割。 * 数据分析：验证清除衰老细胞能否逆转由VSMCs中GSDME过表达所驱动的AAA进展，并确认其作用位于GSDME激活的下游。
四、 主要研究结果
结果一：GSDME依赖性非经典焦亡在AAA中被激活。 在AAA患者和小鼠模型的病变血管壁中，均检测到GSDME被切割激活（N端片段出现），且caspase-3（而非caspase-1）显著上调。公共数据集分析显示，在gasdermin家族中，仅*GSDME*的转录水平在AAA中特异性升高。单细胞数据分析进一步表明，GSDME主要在VSMCs中高表达，而GSDMD主要在免疫细胞中表达。GSDME的表达水平与动脉瘤直径、炎症和基质降解标志物呈正相关，与VSMCs标志物呈负相关。这些结果首次证实了GSDME-caspase-3轴介导的非经典焦亡在AAA病变中被特异性激活。
结果二：全局敲除GSDME显著减轻AAA病理。 在两种不同的AAA小鼠模型中，GSDME敲除均能提高小鼠生存率，抑制主动脉扩张，减轻血管壁中层结构破坏和弹性纤维降解，减少基质金属蛋白酶MMP9的表达，并降低VSMCs的死亡。这表明GSDME是AAA进展的关键驱动因子。
结果三：GSDME调控AAA血管壁中髓系细胞的浸润和炎症状态。 高维流式分析发现，GSDME敲除后，病变血管壁中总的巨噬细胞/单核细胞浸润减少。更重要的是，其亚群分布发生显著改变：促炎的Ly6C高单核细胞和具有抗原呈递能力的MHCII+巨噬细胞比例下降，而具有抗炎/修复功能的Ly6C低单核细胞和组织定居型Tim4+巨噬细胞比例上升。这说明GSDME不仅影响免疫细胞数量，更关键的是重塑了免疫微环境，使其从促炎状态向抗炎/修复状态转变。
结果四：GSDME缺失抑制血管衰老。 GSDME敲除小鼠的AAA病变血管中，SA-β-gal阳性衰老细胞显著减少，衰老标志蛋白（p21， p53， p16， γH2A.X）表达下降，SASP因子分泌降低。流式细胞术证实，这种衰老抑制效应主要发生在VSMCs中。体外实验显示，Ang II+BLM处理可快速诱导VSMCs中GSDME切割和IL-1β释放，并最终导致细胞衰老；而来自GSDME敲除小鼠的VSMCs则能抵抗这种衰老诱导。这建立了GSDME激活→VSMCs焦亡/衰老→SASP分泌的因果关系链。
结果五：多组学分析揭示GSDME缺失抑制衰老相关转录特征和细胞状态重编程。 批量RNA-seq显示，GSDME敲除后，AAA组织中的免疫反应和细胞衰老通路被抑制，而细胞外基质组织通路增强。单细胞RNA-seq进一步在细胞分辨率上证实了这一点：GSVA分析显示，在VSMCs和髓系细胞中，免疫/炎症相关通路（如Toll样受体、JAK-STAT、MAPK通路）和衰老相关通路（如p53信号）被抑制。细胞通讯分析指出，VSMCs是SASP信号的主要靶细胞。对VSMCs的亚群分析发现了五种状态：收缩型、间充质样、成骨样、巨噬细胞样和成纤维细胞样。GSDME敲除保留了更多处于原始状态的收缩型VSMCs，减少了终末分化的巨噬细胞样和成纤维细胞样VSMCs的比例，并抑制了其向促衰老状态的转变。对髓系细胞的分析也显示，GSDME缺失阻碍了单核/巨噬细胞和中性粒细胞向促炎和衰老状态的极化。
结果六：VSMCs（而非髓系细胞）中的GSDME是驱动AAA和血管衰老的关键。 这是本研究的核心发现之一。细胞特异性回补实验表明，仅在VSMCs中回补GSDME（Gsdme^SR小鼠）就足以完全重现野生型小鼠的严重AAA表型，包括高死亡率、主动脉扩张、弹性纤维降解、衰老标志物和SASP因子高表达。相反，仅在髓系细胞中回补GSDME（Gsdme^MR小鼠）则与全局敲除小鼠类似，表现出对AAA的保护作用。这一结果确凿地证明了GSDME通过作用于VSMCs，而非通过调节免疫细胞，来主导AAA的发病。
结果七：Senolytic疗法可缓解GSDME驱动的AAA进展。 使用达沙替尼+槲皮素清除衰老细胞，能有效减轻Gsdme^SR小鼠的血管衰老、降低SASP因子表达、改善血管结构并抑制动脉瘤发展。重要的是，该疗法对GSDME的切割本身没有影响，且对已受保护的Gsdme^stop/stop小鼠无额外益处。这证明GSDME主要通过诱导VSMCs衰老来促进AAA，而靶向衰老细胞本身是一种有效的下游干预策略。
五、 研究结论与意义
本研究得出结论：GSDME依赖性非经典细胞焦亡在AAA中被激活，并通过诱导血管平滑肌细胞衰老，进而驱动AAA的进展。VSMCs中的GSDME是调控这一过程的“主开关”，而清除衰老细胞可作为治疗GSDME相关AAA的潜在策略。
其科学价值在于： 1. 机制创新：首次将GSDME-caspase-3轴介导的非经典焦亡、VSMCs衰老与AAA发病机制联系起来，阐明了从特定细胞死亡模式到细胞衰老，再到器官病理变化的清晰分子通路。 2. 细胞特异性：通过精巧的遗传学模型，明确了GSDME在VSMCs中的细胞特异性核心作用，纠正了以往可能过于关注免疫细胞焦亡的视角。 3. 治疗靶点：不仅指出了GSDME本身是一个潜在的治疗靶点，还验证了senolytic疗法作为干预GSDME下游事件的有效性，为AAA的药物研发提供了新的思路（靶向GSDME或靶向衰老细胞）。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还提出了一个有趣的科学问题：GSDME作为凋亡与焦亡的“平衡开关”，当其被抑制时，caspase-3可能将细胞死亡导向“冷”的凋亡，这可能解释了为何GSDME缺失能减轻炎症和衰老。这暗示了细胞死亡模式的“质控”在疾病发展中的重要性，为理解其他与细胞死亡和衰老相关的疾病提供了新视角。此外，研究中对组织定居型巨噬细胞和不同功能状态中性粒细胞的分析，也为理解AAA中复杂的免疫微环境提供了更精细的图谱。