本文属于类型a，即单一原创研究论文。以下是对该研究的学术报告。

文章信息

本文作者为Ren Jie Phang、Nan Su、Anne M. Kong、Shiang Y. Lim和Jarmon G. Lees，通讯作者为Jarmon G. Lees。作者分别来自澳大利亚St Vincent’s Institute of Medical Research的O’Brien Institute Department、墨尔本大学（The University of Melbourne）的医学与外科学系、莫纳什大学（Monash University）药学院的药物发现生物学部，以及新加坡国立心脏中心（National Heart Research Institute Singapore）。该研究于2025年10月14日在线发表于《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》第209卷，第80至92页，文章DOI为10.1016/j.yjmcc.2025.10.004。

研究背景

2型糖尿病（type 2 diabetes）是全球性的健康危机，其与糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy）导致的心力衰竭风险升高密切相关。糖尿病心肌病被定义为由2型糖尿病引起的心肌结构或功能异常，且独立于冠状动脉疾病和高血压等其他心血管疾病。目前对糖尿病心肌病机制的理解主要来自动物模型和传统二维（2D）细胞培养模型，但啮齿动物与人类之间存在显著生理差异，而原代人类心肌细胞的获取与维持又受限于稀缺性和技术困难。更重要的是，以往模型多忽略心脏中占比约60%的非心肌细胞（non-myocytes），如内皮细胞（endothelial cells）、自主神经元（autonomic neurons）、心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts）等在疾病发生发展中不可或缺的成分。人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, iPSCs）能够大量生成心肌细胞和非心肌细胞，为构建更接近人类心脏生理的先进研究模型提供了可能。本研究旨在构建由iPSC来源的心肌细胞、内皮细胞、自主神经元和心脏成纤维细胞组成的三维（3D）多细胞心脏微组织（multicellular cardiac microtissues），探索高糖高脂（high glucose and high lipid, HGHL）致糖尿病条件下该模型能否更准确地模拟糖尿病心肌病的晚期收缩和舒张功能障碍。

研究流程与方法

本研究首先在2D培养条件下分别考察了各细胞类型对代谢应激的反应。人类iPSC经过定向分化产生心肌细胞、内皮细胞、自主神经元和心脏成纤维细胞。其中，心肌细胞经过CHIR99021和IWP2等小分子时序调控分化，并在无葡萄糖乳酸培养基中富集至心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T, cTnT）阳性率超过95%。内皮细胞分化采用BMP4、CHIR99021和VEGF165方案，通过FACS分选CD31阳性细胞。自主神经元分化通过神经球形成及BDNF、GDNF、NGF成熟诱导。心脏成纤维细胞分化则采用BMP4、activin A、视黄酸等多步信号调控。

在2D实验中，各细胞类型分别暴露于对照组（正常葡萄糖浓度及甘露醇渗透压对照）或致糖尿病条件（30 mM葡萄糖、0.25 mM棕榈酸、0.1 mM油酸和0.1 mM亚油酸）处理7天。对心肌细胞进行了收缩视频分析、钙瞬变（calcium transient）检测、细胞表面积测量、油红O脂质染色、线粒体形态分类（网络状或碎片状）以及线粒体超氧化物和膜电位检测。对内皮细胞进行了管形成实验（tubulogenic assay）、CD31免疫染色、细胞死亡和增殖检测及线粒体功能评估。对自主神经元进行了peripherin和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）染色，并检测细胞死亡、增殖和线粒体功能。对心脏成纤维细胞检测了PDGFRα表达、细胞死亡及线粒体功能。

随后，构建了仅含心肌细胞的3D微组织和多细胞3D心脏微组织。单一心肌细胞微组织每孔接种1.2×10⁵个心肌细胞，多细胞微组织则每孔掺入1.2×10⁵个心肌细胞、5.5×10⁴个内皮细胞、0.5×10⁴个自主神经元和2.0×10⁴个心脏成纤维细胞，通过低吸附圆底板离心聚球。微组织在形成后分别接受对照、HGHL或HGHL加0.5 mM二甲双胍（metformin）处理。收缩功能使用倒置显微镜录像，并通过ImageJ中的MuscleMotion软件分析总收缩时间（total contraction duration）、达峰时间（time to peak）和松弛时间（relaxation time）。这些参数分别反映整体收缩、收缩期和舒张期功能。此外，在第7天对微组织进行活力检测（CellTiter-Glo法）、RT-qPCR检测纤维化相关基因（TGFβ、COL1A1、COL2A1、CTGF、ACTA2）及线粒体融合与分裂相关基因（DNM1L、MFN1、MFN2、MFF、FIS1、OPA1）表达，并进行冰冻切片免疫组化鉴定细胞组成。

主要结果

在2D培养条件下，HGHL处理7天后心肌细胞未出现达峰时间或松弛时间的显著延长，但表现出钙瞬变幅度降低（p<0.01）和异常钙振荡发生频率增加（p<0.01），细胞表面积增大（p<0.05），脂质积累增加（p<0.05），线粒体碎片化比例显著升高（p<0.001），线粒体膜电位降低（p<0.01），而细胞死亡和线粒体超氧化物未显著改变。这些结果提示2D心肌细胞仅能部分模拟糖尿病心肌病的早期细胞病变特征，无法完全复现收缩功能障碍。

在单细胞型3D心肌细胞微组织中，HGHL处理3天未引起收缩参数改变，但第7天时松弛时间显著延长（p<0.01），而达峰时间和总收缩时间无显著变化。二甲双胍未能逆转此舒张功能延长。组织学显示这种微组织主要由心肌细胞组成，仅含少量vimentin阳性间质细胞，缺乏内皮细胞和自主神经元。纤维化相关基因和线粒体动态基因表达无明显改变，细胞活力未受影响。

在2D实验中，HGHL处理使内皮细胞管形成能力下降，网络样环（meshes）数减少（p<0.05），分支连接点减少（p<0.05），细胞死亡增加（p<0.05），线粒体超氧化物升高（p<0.01）。自主神经元在HGHL条件下细胞死亡增加（p<0.05），线粒体超氧化物升高（p<0.01）；心脏成纤维细胞则表现为细胞死亡增加，线粒体超氧化物显著升高近两倍（p<0.0001），且线粒体膜电位降低（p<0.05）。这是首次系统报道人类自主神经元和心脏成纤维细胞对致糖尿病条件的反应。

在多细胞3D心脏微组织模型中，免疫组化证实了心肌细胞、内皮细胞、心脏成纤维细胞和自主神经元在微组织内共存，且HGHL组中成纤维细胞和神经元更多分布于外层区域。与单心肌细胞微组织相比，多细胞微组织在HGHL处理7天后细胞活力显著下降（p<0.01），并显著上调纤维化相关基因TGFβ、COL2A1和ACTA2的表达（p<0.05），提示早期纤维化信号启动。收缩功能分析显示，多细胞微组织在HGHL处理仅3天即出现总收缩时间显著延长（p<0.01）、达峰时间延长（p<0.05）和松弛时间延长（p<0.01）；第7天持续存在总收缩时间延长（p<0.05）、达峰时间延长（p<0.05）和松弛时间延长（p<0.05）。二甲双胍联用可阻止总收缩时间延长，并显著改善松弛时间延长（p<0.05），但对达峰时间延长无效。

这些结果在逻辑上呈现逐步递进的关系。2D实验揭示了各细胞类型对代谢应激的差异反应，其中非心肌细胞对细胞死亡和线粒体氧化应激更为敏感；单心肌细胞3D微组织证明3D结构本身能够使心肌细胞表现出一定的舒张功能异常，但需7天才能显现；而多细胞3D微组织则在仅3天内即复现了类似晚期糖尿病心肌病的收缩和舒张功能障碍，并伴有纤维化基因激活和活力降低，说明非心肌细胞在疾病进展中具有关键的加速作用。

研究结论与价值

本研究的主要结论是：包含心肌细胞、内皮细胞、自主神经元和心脏成纤维细胞的3D多细胞心脏微组织，在致糖尿病条件下能够重现与晚期糖尿病心肌病更接近的收缩和舒张功能障碍，而这些表型在传统2D心肌细胞培养或仅含心肌细胞的3D微组织中无法得到完全或及时复现。非心肌细胞在糖尿病心肌病的疾病进展中发挥关键作用。二甲双胍能够预防舒张功能障碍，验证了该平台用于药物评估的实用性。

本研究在科学价值方面，首次系统描绘了人类iPSC来源的自主神经元和心脏成纤维细胞对致糖尿病条件的反应，强调了非心肌细胞作为潜在治疗靶点的重要性。在应用价值方面，该多细胞心脏微组织平台无需复杂生物反应器即可实现更接近人类心脏的细胞组成和功能测定，为糖尿病心肌病的机制研究和药物筛选提供了更准确、易获得的临床前模型。

研究亮点

本研究使用人类iPSC来源的四种心脏细胞类型构建3D多细胞微组织，系统对比2D和3D模型以及单细胞型和多细胞型微组织在代谢应激下的差异表型，揭示了3D结构和细胞异质性的协同作用对模拟糖尿病心肌病的重要性，并成功利用该平台展示了二甲双胍对舒张功能障碍的预防作用。