关于山奈酚通过抑制细胞凋亡和调控涉及中性粒细胞的神经炎症治疗缺血性中风的网络药理学分析与实验验证研究报告

本报告旨在向国内研究者介绍由Zhang, S.-S.; Liu, M.; Liu, D.-N.; Shang, Y.-F.; Du, G.-H.; Wang, Y.-H. 团队完成，发表于 International Journal of Molecular Sciences 2022年10月21日第23卷第20期的一项原创性研究成果。该研究由中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所（天然药物活性物质与功能国家重点实验室、北京市药物靶点发现与新药筛选重点实验室）的研究人员主导。

一、 研究背景与目的

缺血性中风是全球范围内导致成人永久性残疾和死亡的主要原因之一。尽管溶栓和介入治疗可通过血管再通治疗缺血性中风，但其治疗时间窗狭窄且可能引发缺血再灌注损伤，对神经细胞的保护作用有限。细胞凋亡和神经炎症被认为是脑损伤发生和发展的关键过程。山奈酚是一种天然植物黄酮类化合物，已被证实对包括缺血性中风在内的多种神经系统疾病具有神经保护作用，但其具体作用机制，特别是在调节细胞凋亡和涉及中性粒细胞的神经炎症方面的作用，尚不完全清楚。

因此，本研究旨在通过结合网络药理学分析和体内实验验证的综合策略，系统探究山奈酚治疗脑缺血的潜在作用机制。研究目标聚焦于明确山奈酚在缺血性中风急性期是否通过调节细胞凋亡以及涉及中性粒细胞的神经炎症过程来发挥神经保护作用，并阐明其相关的分子信号通路。

二、 研究详细流程

本研究采用“先预测，后验证”的策略，具体流程如下：

流程一：网络药理学预测分析 1. 靶点预测与收集：首先，研究者利用TCMSP、PubChem和Swiss Target Prediction数据库预测山奈酚的潜在作用靶点，获得100个相关靶点。同时，从OMIM、DisGeNET、GeneCards和TTD数据库中收集与缺血性中风相关的疾病靶点，共1854个。 2. 共同靶点筛选与网络构建：将药物靶点与疾病靶点取交集，获得43个共同靶点。将这些共同靶点输入STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并使用Cytoscape软件进行可视化，得到一个包含36个核心节点和63条边的PPI网络图。 3. 功能与通路富集分析：利用DAVID数据库对共同靶点进行基因本体分析和KEGG通路富集分析。GO分析结果显示，山奈酚治疗缺血性中风主要涉及的生物过程包括“凋亡过程的负调控”、“药物反应”、“炎症反应”等。KEGG通路分析显示，靶点主要富集在雌激素信号通路、Rap1信号通路、PI3K/Akt信号通路、Ras信号通路和VEGF信号通路等，这些通路多与细胞功能调控相关。此外，通过Metascape数据库进行转录因子富集分析，提示SP1、NF-κB1 和 STAT3 可能是关键转录因子。

流程二：体内药效学评估与机制验证 研究对象为成年雄性Sprague-Dawley大鼠（280-300 g），通过大脑中动脉阻塞/再灌注模型建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型。动物分为假手术组、模型组以及山奈酚低、中、高剂量治疗组。山奈酚在再灌注后2小时首次灌胃给药，之后每日一次，持续至实验终点（主要为再灌注后第3天）。

1. 药效学评估：

   • 神经功能缺损评分：采用改良神经功能缺损评分评估大鼠的运动、感觉、平衡和反射功能。
   • 脑梗死体积测定：再灌注后第3天，取脑进行TTC染色，计算脑梗死体积百分比。
   • 脑水肿检测：通过计算缺血侧脑组织的湿重/干重比值来评估脑含水量。

2. 抗凋亡作用机制探究：

   • TUNEL染色：检测缺血半暗带、缺血核心区和纹状体的细胞凋亡情况，计算TUNEL阳性细胞数。
   • Western Blot检测：提取缺血皮层组织蛋白，检测凋亡相关蛋白（Caspase-3, Bax, Bcl-2, Bcl-xl）的表达水平，并计算Bcl-2/Bax比值。同时，检测BDNF-TrkB-PI3K/Akt信号通路中BDNF、TrkB的表达以及PI3K、Akt的磷酸化水平。

3. 抗神经炎症作用机制探究（聚焦于中性粒细胞）：

   • 神经胶质细胞激活与神经元丢失：通过免疫荧光染色，观察缺血脑区神经元标志物NeuN、小胶质细胞标志物Iba-1和星形胶质细胞标志物GFAP的表达变化。
   • 经典炎症通路检测：通过Western Blot检测缺血皮层中炎症蛋白COX-2以及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白（TLR4, MyD88, p-NF-κB p65）的表达。
   • 血脑屏障完整性评估：采用伊文思蓝渗漏实验评估BBB通透性；通过Western Blot检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达。
   • 外周血中性粒细胞活性：再灌注后24小时，采集外周血，使用全自动血液分析仪计数中性粒细胞数量；采用ELISA试剂盒检测血清中髓过氧化物酶活性。
   • 缺血脑内中性粒细胞聚集与浸润：
     • HE染色：观察缺血脑组织中多叶核中性粒细胞的浸润情况。
     • 实时荧光定量PCR：提取缺血皮层总RNA，检测中性粒细胞释放的蛋白酶（MPO, NE, MMP-9, MMP-3）、趋化因子（CXCL1, CXCL9, CXCL10, CCL5）以及炎症因子（TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10）的mRNA表达水平。
     • Western Blot检测：检测缺血皮层中与中性粒细胞相关的蛋白，包括瓜氨酸化组蛋白H3、Galectin-3和细胞间黏附分子-1的表达。
   • JAK1/STAT3信号通路检测：分别提取再灌注后第1天外周血中性粒细胞以及第3天缺血皮层组织的蛋白，通过Western Blot检测JAK1/STAT3信号通路中JAK1、STAT3的蛋白表达及其磷酸化水平。

三、 主要研究结果

1. 网络药理学预测结果：成功预测山奈酚可能通过调控细胞凋亡和炎症反应（特别是涉及中性粒细胞的炎症）来治疗缺血性中风，其作用可能与PI3K/Akt和STAT3等信号通路有关，为后续实验提供了明确的研究方向。

2. 山奈酚对脑缺血再灌注损伤的保护作用：与模型组相比，100 mg/kg山奈酚治疗能显著降低MCAO大鼠的改良神经功能缺损评分、减少脑梗死体积、减轻脑水肿，并促进体重恢复，证实了山奈酚在缺血性中风急性期的神经保护功效。

3. 山奈酚的抗细胞凋亡作用及机制：

   • TUNEL染色显示，山奈酚能几乎完全抑制I/R诱导的TUNEL阳性信号，显著减少凋亡细胞数量。
   • Western Blot结果显示，山奈酚能显著降低促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达，提高抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达，从而升高Bcl-2/Bax比值。
   • 机制上，山奈酚显著上调了缺血皮层中BDNF和TrkB的蛋白表达水平，并增强了PI3K和Akt的磷酸化。这表明山奈酚可能通过激活BDNF-TrkB-PI3K/Akt信号通路来发挥抗凋亡作用。

4. 山奈酚的抗神经炎症作用及机制（聚焦中性粒细胞）：

   • 抑制神经胶质细胞激活与神经元丢失：山奈酚能显著增加缺血脑区NeuN阳性神经元数量，同时减少Iba-1和GFAP阳性细胞的数量和体积，表明其能抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活，并减轻神经元丢失。
   • 抑制经典炎症通路：山奈酚能下调缺血皮层中炎症蛋白COX-2以及TLR4、MyD88的表达和NF-κB p65的磷酸化水平。
   • 保护血脑屏障：山奈酚能减少伊文思蓝的脑内渗漏，并上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，表明其能减轻BBB破坏。
   • 抑制外周血中性粒细胞活化：山奈酚治疗能降低I/R引起的外周血中性粒细胞计数和血清MPO活性的升高。
   • 减少中性粒细胞在缺血脑内的聚集与浸润：
     • HE染色显示，山奈酚显著减少了缺血脑组织中浸润的中性粒细胞数量。
     • qPCR结果显示，山奈酚能显著下调缺血皮层中多种由中性粒细胞释放的蛋白酶（MPO, NE, MMP-9, MMP-3, Galectin-3）、趋化因子（CXCL1, CXCL9, CXCL10, CCL5）和促炎因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）的mRNA表达，同时上调抗炎因子IL-10的表达。
     • Western Blot结果显示，山奈酚能降低缺血皮层中CitH3、Galectin-3和ICAM-1等中性粒细胞相关蛋白的表达。
   • 下调JAK1/STAT3信号通路：山奈酚能显著降低I/R引起的缺血皮层以及外周血中性粒细胞中JAK1蛋白表达和STAT3蛋白磷酸化水平的升高。结合网络药理学预测（STAT3为关键转录因子），提示山奈酚可能通过抑制JAK1/STAT3信号通路来调控中性粒细胞的活化和功能。

四、 研究结论与意义

本研究通过整合网络药理学和体内实验验证，系统阐明了山奈酚治疗缺血性中风的作用机制。结论表明，山奈酚在急性期脑缺血再灌注损伤中具有明确的神经保护作用，其机制涉及两个方面：1）通过上调BDNF-TrkB-PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡；2）通过下调JAK1/STAT3信号通路，抑制中性粒细胞的活化、聚集和向缺血脑组织的浸润，从而调节神经炎症。该研究不仅加深了对山奈酚多靶点、多通路神经保护作用的理解，也为将山奈酚开发为治疗缺血性中风的潜在药物提供了重要的临床前实验依据。

五、 研究亮点

1. 研究策略新颖：采用“网络药理学预测指导实验验证”的综合研究策略，使机制探索更具系统性和针对性，提高了研究效率。
2. 研究视角聚焦：首次系统、深入地探究了山奈酚在缺血性中风中对“中性粒细胞”这一关键外周免疫细胞的作用，拓展了对其抗炎机制的认识。
3. 机制阐述深入：不仅验证了山奈酚的抗凋亡（通过PI3K/Akt通路）和抗炎（通过TLR4/NF-κB通路）作用，还创新性地将其中性粒细胞调控作用与JAK1/STAT3信号通路联系起来，形成了从外周免疫细胞活化到中枢炎症损伤的完整证据链。
4. 实验设计全面：从整体动物行为学、组织病理学、到分子蛋白及基因表达水平，从外周血到脑组织，进行了多层次、多角度的验证，数据详实，论证充分。

六、 其他有价值的内容

本研究还提供了详细的研究方法，包括MCAO模型构建、神经功能评分、TTC染色、TUNEL染色、免疫荧光、Western Blot、qPCR等实验的具体参数和步骤，以及所使用的抗体和引物序列（见表1），为其他研究者重复和借鉴该研究提供了便利。此外，文章指出STAT3在脑炎症中的作用存在争议（既促进细胞死亡也参与神经元存活），这为未来更深入的研究指明了方向。