本研究由丹麦技术大学（DTU）化学与生物化工系PROSYS研究中心的Maryam Jamshidzadeh、Antonia Ursula Griesz、Jesper Wang Jensen、Ulrich Krühne、John M. Woodley、Krist V. Gernaey、Helena Junicke以及DTU生物可持续性中心（诺和诺德基金会生物可持续性中心）的Pablo Ivan Nikel共同完成。论文发表于《Biochemical Engineering Journal》第213卷（2025年），文章编号109549，于2024年10月28日在线发表。

该研究属于生物过程工程与计算流体力学（computational fluid dynamics，CFD）的交叉领域，聚焦于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）补料分批发酵工艺从实验室规模（2 L）到中试规模（200 L）的放大问题。发酵过程放大在生物制造中具有重要经济与环境价值，但由于大型反应器内混合不均匀会形成底物和溶解氧的浓度梯度，导致微生物所处微环境发生显著变化，进而影响产物收率与质量。传统放大方法通常仅维持单一参数恒定，如恒定叶端速度（tip speed）、恒定单位体积功率（power per unit volume, P/V）或恒定体积传质系数（volumetric mass transfer coefficient, kLa），但这些方法均无法全面保障放大后的工艺性能。因此，本研究的核心目标是开发一种基于CFD模拟、并结合统计分析的放大策略，以降低放大风险，优化200 L中试反应器的操作条件。

研究流程主要分为四个阶段：实验装置与验证数据获取、CFD模型构建与验证、响应面分析、动力学耦合与梯度评估。首先，实验系统包括两个几何不相似的搅拌式生物反应器：2 L实验室规模反应器（Applikon ez-Control）和200 L中试规模反应器（Sartorius Biostat® D-DCU）。中试反应器配备三个六叶Rushton涡轮桨（直径0.2 m），桨间距0.356 m，并在挡板上安装光学氧探头用于实时监测溶解氧。实验测量了不同装液体积（87 L、150 L、200 L）下的混合时间（mixing time）和kLa。混合时间通过pH脉冲法测定，使用由丙二酸和琥珀酸组成的线性缓冲液体系，在自制挡板上安装10个pH探针以捕获不同位置的pH响应；kLa则采用静态排气法（static gassing-out method）在空气-水系统中测定，重复三次。第二，CFD模型采用欧拉-欧拉双流体模型，液相与气相之间的相间作用力通过Ishii-Zuber曳力模型和Burns湍流分散力模型描述，湍流采用Realizable k-ε模型封闭，桨叶旋转通过滑移网格（mesh motion）技术实现。中试反应器采用了55万余个六面体结构化网格，经网格无关性检验确认该中等网格在计算精度与时间成本之间取得最佳平衡。气泡直径在实验室和中试尺度分别设为0.001 m和0.003 m。传质系数kl通过Lamont和Scott关联式计算，界面面积a采用基于局部气含率与网格单元体积的分段公式以修正高气含率区域的线性假设误差。第三，采用中心复合设计（central composite design，CCD）构建响应面模型，输入变量为通气速率（0.5、1、1.5 vvm）、搅拌转速（230、275、320 rpm）和装液体积（87、150、200 L三个分类水平）。输出响应包括流体动力学参数（P/V、气含率、kLa、混合时间、湍流耗散率、通气功率与不通气功率之比Pg/Pug）和动力学参数（比生长速率、底物浓度、溶解氧浓度）。第四，在流场稳定后，将Monod动力学模型通过用户自定义函数（user-defined function）耦合至CFD求解器中，模拟了补料位置和顶部进料条件下的底物消耗、氧气吸收与生物量生成，并以Damköhler数（Da）评估梯度形成风险。

实验结果显示，200 L反应器在最大装液量下，有气条件下的混合时间随转速增加而降低：250 rpm时34.78 s，500 rpm时20.78 s，且显著高于无气条件。CFD模拟对混合时间的预测误差在低转速时最大为19.2%，中高转速时误差在8.6%以内。对于150 L装液量，预测误差在4.41%至7.91%之间。在87 L最低装液量下，由于液面不稳定和酸碱脉冲结果不一致，实验混合时间数据不可靠，未用于模型验证。kLa验证方面，在250 rpm、1 vvm、200 L条件下，实验测得平均kLa为256.5 h⁻¹，CFD模拟值为263.8 h⁻¹，偏差仅2.8%。此外，将CFD平均kLa与常用经验关联式（kLa = 0.026(P/V)^0.4(νs)^0.5）对比发现，在高通气速率下经验关联式显著低估了kLa值，说明基于CFD的传质预测更能反映实际体系中的局部流动与相界面分布特征。

响应面分析表明，所有主效应对六个流体动力学响应均显著（p < 0.05），各二次模型的R²均超过0.99，说明二次多项式模型能够有效描述输入变量与响应之间的关系。模型揭示kLa随通气速率和搅拌转速增加而单调上升，但在不同装液体积下存在交互效应：在较大装液体积下，由于更多桨叶被浸没且气含率更高，相同操作条件下可获得更高的kLa。然而，高装液量也导致混合时间显著延长，从87 L时的3–9 s增加到200 L时的28–46 s。根据Damköhler数分析，本研究中当混合时间超过24.6 s时即可能出现底物和溶解氧梯度。在200 L装液量下，所有测试操作条件的混合时间均超过该临界值，意味着发酵后期无法避免梯度形成；而在87 L和150 L装液量下，除少数高转速低通气条件外，大部分操作点可维持混合时间低于临界值。

动力学耦合模拟进一步揭示了不同设计点下的浓度场分布。在kLa低于实验室尺度的灰色区域内，200 L反应器内出现明显的氧耗竭区和葡萄糖积累区，比生长速率呈现显著的空间异质性。在kLa达到或高于实验室尺度428 h⁻¹的黄色区域内，溶解氧充足，但该区域的操作条件往往要求高通气或高搅拌功率。研究还引入两个工程约束条件用于划定推荐操作窗口：一是P/V不应超过实验室尺度的3000 W/m³，二是Pg/Pug不应低于0.7，以避免桨叶发生气泛（flooding）导致功率传递效率急剧下降。在200 L装液量下，同时满足高kLa和低混合时间的黄区不存在，因此最终推荐的操作窗口是在避免氧耗竭的前提下，尽量降低功率输入并维持Pg/Pug在可接受范围内。

本研究的核心结论是：仅依靠单一的传统放大准则无法保障恶臭假单胞菌补料分批发酵从2 L到200 L的低风险放大。通过将CFD流体动力学模拟与Monod动力学模型及响应面方法相结合，可以构建中试反应器的性能图谱，定量评估不同操作条件下氧传递、混合质量和梯度形成风险。研究表明，在反应器装液量达到200 L时，梯度形成不可避免，但通过合理选择转速和通气速率，可以在不过度增加比功率消耗的前提下减轻梯度严重程度。该方法论框架不仅适用于恶臭假单胞菌发酵，还可推广至其他需氧微生物补料分批工艺的放大过程，有助于降低放大过程中的试错成本，提升工艺开发效率。

本研究的主要亮点在于：首先，开发并实验验证了适用于补料分批发酵动态装液过程的多相CFD模型，模型对混合时间和kLa均具有良好预测精度；其次，首次将响应面方法与CFD模拟相结合，生成中试反应器操作性能图谱，实现了对放大操作窗口的系统性界定；第三，将Monod动力学模型与三维流体动力学模型双向耦合，能够捕获溶解氧和底物浓度在反应器内的空间分布，从而直接评估微生物在非理想混合环境中的生长异质性；第四，明确指出了传统放大准则的局限性，并通过Damköhler数与Pg/Pug约束条件提出了一种多准则综合的放大决策路径。此外，文中自制的多探针挡板装置和对线性缓冲液体系的应用也为混合时间实验测量提供了可靠的技术手段，具有方法学参考价值。