本研究由Robert Nason、Jae Y. Jung和Richard A. Chole（通讯作者）合作完成，作者单位均为美国圣路易斯华盛顿大学医学院（Washington University School of Medicine）的耳鼻喉科/头颈外科、分子药理学及中央聋哑研究所。研究发表于2009年1月的Journal of the Association for Research in Otolaryngology (JARO)，标题为《Lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis from mononuclear precursors: a mechanism for osteolysis in chronic otitis》。
科学领域：本研究属于感染性骨溶解机制领域，聚焦于慢性中耳炎（COM）和感染性胆脂瘤中由细菌引发的骨质破坏。
研究动机：铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）是慢性中耳疾病中最常见的病原体，其细胞壁成分脂多糖（LPS）可通过炎症反应促进骨吸收，但具体机制尚未明确。
关键科学问题：
1. LPS是否能直接刺激破骨前体细胞（POCs）分化为功能性破骨细胞（OCs）？
2. 这一过程是否需要其他细胞（如成骨细胞或淋巴细胞）的参与？
3. 哪些细胞因子和受体通路在LPS介导的破骨细胞生成中起关键作用？
1. 研究对象与模型
- 细胞模型：
- 原代破骨前体细胞（POCs）：从C57BL/6小鼠骨髓中分离，培养于含M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）和低剂量RANKL（10 ng/ml，亚破骨细胞生成剂量）的培养基中。
- RAW 264.7细胞系：作为均质化模型验证原代细胞结果。
- 基因敲除模型：使用IL-6−/−、TNFR1−/−、TNFR2−/−、TNFR1/2−/−和IL-1R1−/−小鼠的POCs，以验证特定细胞因子的作用。
2. 关键实验流程
- RANKL预激活（Priming）：POCs需经72小时低剂量RANKL预处理，以定向分化为破骨细胞谱系。
- LPS刺激：预激活后，加入铜绿假单胞菌LPS（1 μg/ml），观察多核破骨细胞形成。
- 细胞因子分析：通过抗体芯片检测LPS刺激后POCs释放的40种炎症因子（如TNF-α、IL-1α、IL-6）。
- 骨吸收功能验证：将OCs培养于羟磷灰石涂层片或象牙质切片上，通过甲苯胺蓝染色量化骨吸收面积。
- 实时定量PCR：分析NFATc1（破骨细胞分化关键转录因子）、TNFR1/2和IL-1R1的基因表达动态。
3. 创新方法
- 自主破骨细胞生成模型：首次证明POCs在无支持细胞（如成骨细胞）条件下，仅通过LPS刺激即可完成分化，揭示了细胞自主性骨溶解机制。
- 时间依赖性RANKL预激活窗口：发现LPS的促破骨作用仅存在于RANKL预激活后的特定时间窗口（24–72小时）。
1. LPS直接诱导破骨细胞生成
- 预激活的POCs在LPS刺激后形成多核TRAP阳性OCs，且能有效吸收骨基质（图1D）。
- RAW 264.7细胞实验结果与原代细胞一致，排除了非POCs细胞的干扰。
2. 细胞因子网络的自主激活
- 关键细胞因子：LPS刺激后，POCs释放TNF-α、IL-1α、IL-6、MCP-1等促破骨因子（图2E）。
- 受体上调：实时PCR显示TNFR1、TNFR2和IL-1R1表达显著增加（TNFR2在24小时即上调16倍，图5），形成正反馈循环。
3. 基因敲除验证
- IL-6−/−或TNFR1/2−/− POCs的破骨能力显著受损（图4A–C），证实这些通路不可或缺。
- IL-1R1拮抗剂（IL-1RA）可剂量依赖性抑制OCs形成（图4D），提示IL-1的自分泌作用。
1. 科学价值
- 提出“RANKL预激活-LPS触发”的双阶段破骨细胞生成模型，为慢性中耳炎骨破坏提供新机制解释。
- 揭示POCs通过自主分泌炎症因子（如TNF-α、IL-1）驱动骨溶解的病理循环，为靶向治疗提供潜在靶点（如阻断TNFR2或IL-1R1）。
2. 应用前景
- 针对慢性中耳炎合并骨破坏的患者，可探索联合抗生素与细胞因子抑制剂（如抗TNF-α药物）的治疗策略。
- 该模型可推广至其他细菌性骨感染（如骨髓炎）的研究。