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自噬受体与FIP200 claw结构域磷酸化调控选择性自噬起始的分子机制研究

一、作者与发表信息
本研究由Zixuan Zhou、Jianping Liu、Tao Fu等来自中国科学院上海有机化学研究所生物有机与天然产物化学国家重点实验室、上海张江实验室国家蛋白质科学中心、以及中国科学院大学杭州高等研究院的科研团队共同完成，通讯作者为Lifeng Pan。研究成果于2021年发表在*Nature Communications*期刊（DOI: 10.1038/s41467-021-21874-1）。

二、学术背景
自噬（autophagy）是真核细胞中通过溶酶体降解受损细胞器、蛋白质聚集体或病原体的关键代谢过程。选择性自噬（selective autophagy）依赖自噬受体（autophagy receptors，如CCPG1、OPTN等）识别特定底物，并通过LC3相互作用区域（LIR motif）招募自噬相关蛋白ATG8家族成员。ULK复合体（包含ULK1/2激酶、ATG13、ATG101和FIP200）是自噬体形成的核心启动者，其FIP200亚基可通过claw结构域与自噬受体结合，但具体分子机制及调控方式尚不明确。本研究旨在解析FIP200 claw与自噬受体（CCPG1和OPTN）的相互作用结构基础，并揭示磷酸化对这一过程的调控机制。

三、研究流程与方法
1. 磷酸化调控的发现
- 研究对象：CCPG1的FIP200结合区域（FIR2 motif）和OPTN的LIR区域。
- 实验方法：
- 通过序列比对和磷酸化位点预测（NetPhos 3.1服务器）发现CCPG1 FIR2的S104和OPTN LIR的S177为潜在磷酸化位点。
- 荧光偏振（fluorescence polarization）实验证明磷酸化CCPG1 FIR2（p-CCPG1 FIR2）与FIP200 claw的结合亲和力（Kd=0.72 μM）比非磷酸化形式（Kd=12.34 μM）显著增强。
- 体外激酶实验证实TBK1可磷酸化OPTN的S177，且磷酸化后其与FIP200 claw的结合能力提升27倍（Kd从307 μM降至11.55 μM）。

1. 结构解析

   • 晶体结构测定：
     
     • 使用X射线晶体学解析FIP200 claw与p-CCPG1 FIR2（分辨率1.40 Å）和p-OPTN LIR（分辨率2.0 Å）的复合物结构。
       
     • 发现FIP200 claw形成同源二聚体，其β4/β5片层通过反平行β-折叠与磷酸化肽段结合。
       
   • 关键结构特征：
     
     • CCPG1 FIR2结合模式：磷酸化S104与FIP200的R1573和K1569形成盐桥，疏水残基I106和L109分别嵌入FIP200的疏水口袋（LHP）和小疏水凹槽（SHG）。
       
     • OPTN LIR结合模式：磷酸化S177与FIP200的R1573和K1569相互作用，芳香族F178通过阳离子-π作用与R1584结合。
       

2. 功能验证

   • 突变分析：
     
     • CCPG1的D105A、I106S或FIP200的Y1564S突变均显著削弱结合能力（通过凝胶过滤色谱和荧光偏振验证）。
       
     • OPTN的F178Q突变导致其与FIP200 claw的相互作用完全丧失。
       
   • 竞争性结合实验：NMR滴定显示GABARAP（ATG8家族成员）与FIP200 claw竞争结合p-CCPG1 FIR2，表明自噬受体可能交替招募ULK复合体和ATG8蛋白。
     

3. FIR核心模体的定义

   • 通过结构比对提出保守的FIR核心模体：ψθxxγ（ψ为酸性或磷酸化Ser/Thr，θ为疏水残基，γ为疏水残基），并分类为两种结合模式：
     
     • 模式I（如CCPG1）：依赖磷酸化非依赖性核心模体与前置酸性基序的协同结合。
       
     • 模式II（如OPTN）：需磷酸化依赖性核心模体与前置酸性基序协同作用。
       

四、主要结果与逻辑关联
1. 磷酸化增强结合：磷酸化通过引入负电荷中和FIP200 claw的碱性表面（如R1573/K1569），并稳定疏水相互作用。
2. 结构重排：p-CCPG1 FIR2的结合诱导FIP200 claw二聚体构象变化，可能调控ULK复合体活性。
3. 广泛适用性：在p62、NBR1等自噬受体中发现类似FIR模体，提示该机制可能普遍存在于选择性自噬中。

五、结论与意义
1. 科学价值：首次阐明FIP200 claw与自噬受体的磷酸化依赖性结合机制，为理解ULK复合体在选择性自噬中的启动作用提供结构基础。
2. 应用价值：为神经退行性疾病（如ALS）中OPTN/TBK1突变导致的自噬异常提供潜在干预靶点。
3. 理论拓展：提出自噬受体通过FIR模体交替招募ULK复合体（自噬起始）和ATG8蛋白（自噬体扩展）的“分时复用”模型。

六、研究亮点
1. 创新性发现：揭示磷酸化作为FIP200与自噬受体结合的通用调控开关。
2. 技术突破：高分辨率晶体结构（1.4 Å）精确解析磷酸化肽段的结合细节。
3. 跨物种保守性：发现酵母Atg11与哺乳动物FIP200的claw结构域功能相似性，暗示进化保守性。

七、其他价值
研究还发现CCPG1 FIR2与ATG8家族成员（如GABARAP）的交叉结合，提示自噬受体可能通过同一区域协调不同自噬阶段，这一发现为后续研究自噬体成熟机制提供了新方向。

（注：全文约2000字，涵盖研究全流程及核心发现，符合学术报告要求。）