这是一篇发表于Frontiers in Molecular Biosciences期刊2022年6月9日的学术综述文章，题目为“Current advances in CETSA”，通讯作者为Tuomas Aleksi Tolvanen，其所属机构为瑞典卡罗林斯卡学院医学院索尔纳分院风湿病学系以及瑞典索尔纳Pelago Bioscience AB公司。本文旨在系统性地介绍并讨论细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay，简称CETSA）技术的最新进展、不同变体、应用场景及其在药物发现领域的重要价值。

CETSA技术概览与核心原理

本文的核心主题是CETSA技术及其在靶点识别与验证中的关键作用。文章开篇即强调，确认候选药物与其预期靶点的结合是药物发现流程中至关重要的一环。CETSA作为一种无标记（label-free）技术，基于配体结合会改变蛋白质热稳定性的经典原理。与传统热位移分析（TSA）使用纯化重组蛋白不同，CETSA的创新之处在于能够在完整细胞或细胞裂解液这一更接近生理环境的体系中进行，从而更真实地反映药物在细胞内的靶点结合情况。自2013年首次被报道以来，CETSA已发展出多种检测形式：基于西方墨点法（Western Blot, WB）的CETSA主要用于验证分子与特定靶蛋白的结合；基于珠化学检测的高通量CETSA（CETSA HT）适用于针对预定靶点的大规模化合物库筛选；而基于质谱（Mass Spectrometry, MS）的CETSA，即热蛋白质组分析（Thermal Proteome Profiling, TPP），则成为了强大的靶点去卷积（target deconvolution）工具，能够一次性检测样本中超过7000种蛋白质的热稳定性变化，不仅可识别预期靶点，还能发现导致不良反应的脱靶（off-target）结合。

不同无标记细胞靶点结合研究方法的比较

文章花费相当篇幅将CETSA与其他几种主流的无标记细胞靶点结合研究方法进行了详细比较，认为这些方法应互为补充而非相互竞争。 1. SPROX（蛋白质氧化速率稳定性分析）、DARTS（药物亲和反应靶点稳定性分析） 和LiP（有限蛋白酶解）：这三种方法均基于配体结合改变蛋白质构象的原理。DARTS和LiP利用蛋白酶对不同构象蛋白的可及性差异，通过质谱检测差异切割的肽段；SPROX则利用化学变性剂梯度和氧化剂，通过检测蛋氨酸氧化模式的差异来反映蛋白质去折叠情况。它们的优势在于能提供潜在的配体结合位点信息，这是CETSA所不能的。但其主要局限在于严重依赖单一肽段的数据，可能增加假阳性率，且实验前需裂解细胞。 2. NanoBRET（纳米生物发光能量共振转移）：该方法与上述技术差异较大，需要构建表达荧光素酶标记靶蛋白的细胞系。配体结合改变靶蛋白构象，进而影响荧光素酶活性。文章也提及了其衍生技术bitsa（HiBiT热位移分析），它结合了CETSA和部分NanoBRET技术，创建了一种无需抗体的高通量检测系统。 3. CETSA的核心优势：文章特别强调了CETSA在样本基质（sample matrix）选择上的灵活性。SPROX、DARTS和LiP只能使用细胞/组织裂解液；NanoBRET可在完整细胞或裂解液中进行，但通常使用完整细胞。而CETSA既能用于完整细胞，也能用于裂解细胞和组织。使用完整细胞时，只有能穿透细胞膜的化合物（或作用于表面受体）才能产生效应，且细胞内的生物学过程是活跃的，蛋白质处于其天然微环境和蛋白复合体中，因此除了能检测直接的配体-蛋白质相互作用，还能研究相关的通路效应（pathway effects）。这种灵活性使得从不同基质获得的数据可以相互补充，揭示仅在某一种基质中才能观察到的靶点相互作用。

CETSA技术格式的演化与通量提升

本文系统梳理了CETSA技术格式的演进，特别是基于质谱的CETSA MS的各种变体。 1. 基本格式：熔解曲线与剂量反应曲线：CETSA实验可生成蛋白质熔解曲线（在不同温度下检测可溶蛋白量）或等温剂量反应（ITDR）曲线（在单一温度下测试不同化合物浓度）。前者用于确认结合事件，后者用于评估化合物效力。 2. 2D CETSA MS / TPP（热蛋白质组分析）：这是获取信息最全面的格式，即在每个浓度点都运行熔解曲线，反之亦然。它能为每个受化合物影响的蛋白质同时提供熔解曲线和剂量反应数据，便于结果解读，尤其是当热位移（ΔTm）较小时。但其缺点是样品需求量巨大（每次实验约需10^8个细胞），质谱仪器运行时间长，数据分析和统计概览较为困难。 3. 压缩格式CETSA MS / PISA（蛋白质组整体溶解度改变分析）：为克服2D格式的缺点，研究人员开发了压缩格式。其核心是将温度梯度中的样品合并为一个或几个样本进行质谱分析，通过比较处理组与对照组曲线下面积（AUC）的差异（δAUC）来识别靶点。这显著减少了样品量和质谱运行时间。文章还讨论了其变体，如选择三个特定温度进行合并以提高分辨率，或使用单一温度（等温位移分析，ITSA），但后者只能检测在所选温度附近发生位移的蛋白质。 4. 通量的提升：质谱检测通量的提升很大程度上依赖于多重标记技术。文章指出，16重串联质量标签（16-plex TMT）试剂的出现显著提高了CETSA MS的吞吐量。研究显示，与传统的11重TMT相比，使用16重TMT可以在一半的机器时间内检测到几乎相同数量的蛋白质，并额外发现5%的显著位移激酶。作者以EUbOPEN项目为例，说明了如何利用16重TMT设置，在两周内用一台质谱仪筛选52种化合物的结合谱。尽管其通量仍远低于CETSA HT或NanoBRET（后者可同时处理多个384孔板），但压缩CETSA MS能一次性提供7000-8000种蛋白质的热稳定性数据，使其成为评估全局可及蛋白质组（global accessible proteome）熔化行为的强大工具。

CETSA的应用实例与最新进展

文章通过具体案例和最新研究方向，展示了CETSA技术的广泛应用。 1. 阐明生物学通路与作用模式（MoA）：利用完整细胞进行的全蛋白质组CETSA MS能够揭示化合物引发的生物学通路变化，从而帮助解析其详细的作用模式。例如，研究揭示了抗癌药物5-氟尿嘧啶（5-FU）除了作用于已知靶点胸苷酸合成酶（TYMS）外，还显著影响了RNA修饰相关蛋白，这可能是其细胞毒性的关键机制，并提示这些蛋白可作为评估5-FU疗效的生物标志物。另一研究则发现三种不同抗癌化合物（RITA、AF和ONC-1）通过靶向mRNA加工和转录，并在氧化应激下抑制这些过程，从而展现出癌细胞特异性。 2. 结合其他靶点去卷积方法：文章强调了正交方法联用的价值。例如，将压缩格式的SPROX与CETSA MS结合，两者覆盖的蛋白质组部分重叠又各有独特发现，能提供更互补的信息，甚至有助于确定化合物结合位点。另一项关于新型CDK9抑制剂的研究，结合了化学蛋白质组学、激酶亲和工具（Kinobeads）、CETSA MS和LiP，共同提供了抑制剂特异性的有力证据。 3. 细胞表面热蛋白质组分析：针对许多位于细胞表面的药物靶点（如受体），研究人员开发了适用于研究跨膜蛋白靶点结合的CETSA方法。最新进展包括一种无需去污剂的CETSA MS方法，通过富集生物素化的细胞表面蛋白来专门研究质膜蛋白的热稳定性变化。 4. 单细胞CETSA：这是2021年引入的最令人兴奋的新应用之一。它将CETSA的检测通量从百万细胞级别降低到数百个细胞，甚至单个细胞水平。这使利用珍贵临床样本（如细针穿刺活检组织）进行药物测试成为可能。该技术通常结合微流控芯片和荧光成像（如全内反射荧光显微镜，TIRF）来检测靶蛋白的拷贝数变化。文章展望了单细胞质谱与单细胞CETSA结合的可能性，这或将开创CETSA应用的新领域。

结论、意义与展望

在结论部分，文章重申了CETSA在靶点结合研究中已确立的关键地位。作者强调，为了开发安全有效的药物或优质化学探针，仅仅知道分子结合预期靶点是不够的，还必须了解其与其他蛋白质或脱靶点的结合情况。基于质谱检测的CETSA MS是同时检测最多蛋白质、进行靶点去卷积的最有效方法。尽管SPROX或DARTS/LiP等正交方法不能覆盖完全相同的蛋白质组部分，但它们能提供额外的确认和新信息，联用价值显著。

文章提出，将高通量筛选（如CETSA HT）与CETSA MS结合，可能成为一种有益的策略，用于进行更具生理相关性的构效关系（SAR）研究。首先用高通量方法筛选大型化合物库，剔除无结合或弱结合的化合物，然后对剩余化合物进行压缩CETSA MS分析，以确定其共同靶点和脱靶点。

最后，作者展望了CETSA的未来方向。利用完整细胞作为研究基质，结合CETSA观察到的生物学效应，再与传统蛋白质组学、RNA转录组学和代谢组学数据整合，能够提供关于化合物系统性作用模式的宝贵信息。随着研究体系从活细胞升级到人工组织模型，甚至离体组织，将能更准确地评估化合物在人体内的真实生物效力和潜在不良后果。通过提供关于候选药物在活细胞、组织模型和离体组织中如何工作的更深入的生物学理解，CETSA及相关技术将助力未来开发出更高效、更安全的药物。