基于特洛伊木马仿生的脂蛋白纳米载体用于眼底新生血管的无创抗VEGF治疗

第一作者及机构
本研究由上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院眼科的Lin Chen、Minghao Chen、Shiqi Yang和Xiaodong Sun团队主导，合作单位包括上海交通大学医学院药理学与化学生物学系的Chen Fan、Antian Wang等研究者。研究成果发表于《Advanced Materials》（《先进材料》）期刊，DOI号为10.1002/adma.202508104。

学术背景
眼底新生血管是缺血性和炎症性眼底疾病（如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等）导致视力丧失的主要原因。目前临床主要通过玻璃体内注射（intravitreal injection, IVT）抗VEGF（血管内皮生长因子）药物（如阿柏西普aflibercept）治疗，但这种方式具有侵入性，且需频繁注射，可能导致白内障、玻璃体出血等并发症。因此，开发无创、高效的眼部给药系统成为研究热点。

本研究提出了一种仿生脂蛋白纳米载体（a-PA-αCPP），其灵感来源于特洛伊木马策略：通过磷脂酸（phosphatidic acid, PA）介导的静电结合负载阿柏西普，并整合细胞穿透肽（cell-penetrating peptide, CPP）功能化的载脂蛋白A1模拟肽（αCPP），实现无创滴眼给药治疗眼底新生血管。

研究流程与实验方法
1. 分子设计与相互作用验证
- 结构预测与模拟：通过AlphaFold3预测阿柏西普和αCPP的构象，结合分子动力学（MD）模拟分析PA与阿柏西普的相互作用。结果显示，PA的负电荷头部与阿柏西普的带正电氨基酸残基（如精氨酸、赖氨酸）通过静电-氢键转换模型结合。
- 实验验证：等温滴定量热法（ITC）证实PA与阿柏西普的解离常数（Kd）为3.08 μM，与αCPP的Kd为203.30 nM，表明PA可稳定结合两者。圆二色谱（CD）显示，PA能诱导αCPP形成α-螺旋结构，增强其膜穿透能力。

1. 纳米载体构建与表征

   • 组装策略：以1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸（DOPA）为唯一磷脂，通过薄膜水化法形成脂质体，再依次负载阿柏西普（形成a-PA）和αCPP（形成a-PA-αCPP）。
     
   • 理化性质：
     
     • 形态与尺寸：透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）显示载体为单分散球形，直径约120 nm，多分散指数（PDI）<0.3。
       
     • 稳定性：4℃储存2个月后，粒径和zeta电位（-30.7 mV）无显著变化。
       
     • 载药效率：纳米流式细胞术和超滤法测得阿柏西普封装效率达89.2%，αCPP达96.7%。
       

2. 屏障穿透机制研究

   • 细胞实验：在人角膜上皮细胞（HCECs）和视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）中，a-PA-αCPP的摄取效率比游离阿柏西普高15.7倍，且能绕过溶酶体降解。
     
   • 跨细胞转运：Transwell模型显示，a-PA-αCPP通过促进内吞和调节紧密连接蛋白（ZO-1、E-cadherin）实现跨角膜屏障转运。
     
   • 体内分布：小鼠滴眼后，荧光示踪显示纳米载体通过角膜和结膜-巩膜-脉络膜双途径到达视网膜，8小时后视网膜药物浓度达325.35 ng/g，超过阿柏西普的IC50（1.8 ng/mL）。
     

3. 抗血管生成效果评估

   • 体外实验：在VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，a-PA-αCPP抑制迁移和管形成的能力显著优于游离阿柏西普（p<0.001）。
     
   • 离体实验：小鼠脉络膜外植体模型中，a-PA-αCPP使血管出芽面积减少至对照组的15.5%。
     
   • 体内疗效：激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）小鼠模型中，a-PA-αCPP滴眼治疗14天的效果与单次玻璃体注射相当：荧光素渗漏减少82.98%（IVT为79.49%），CNV厚度减少57.06%（IVT为57.39%）。
     

主要结果与逻辑关联
- PA的蛋白结合特性与αCPP的穿透能力协同增强了载体的跨屏障效率（图1-3数据支持）。
- 体外和离体实验证明a-PA-αCPP的抗血管生成活性（图4），为体内疗效奠定基础。
- 体内分布与药效学数据（图3k、图5）验证了无创给药的可行性，且安全性评估（图6）显示其对角膜、视网膜无毒性。

结论与价值
1. 科学价值：首次利用PA作为单一磷脂构建仿生纳米载体，揭示了其通过静电-氢键转换模型稳定负载蛋白的机制。
2. 应用价值：提供了一种居家无创治疗眼底新生血管的方案，可替代频繁的玻璃体注射。
3. 扩展性：该平台可适配其他蛋白药物，如抗炎因子或基因编辑酶。

研究亮点
- 创新载体设计：PA介导的蛋白负载与CPP功能化整合，克服了传统脂质体对亲水大分子的低亲和力。
- 高效无创递送：滴眼给药实现视网膜药物浓度达治疗水平，为临床转化提供可能。
- 多模态验证：结合MD模拟、超分辨显微镜（OMX SR）和纳米流式细胞术（nanoFCM），全面表征载体特性。

其他价值
- 安全性数据表明，长期滴眼不会引起角膜或视网膜损伤（ERG和H&E结果支持）。
- 研究提出的“特洛伊木马”策略为其他组织屏障（如血脑屏障）的药物递送提供了参考。