本研究由Futa Yatabe、Taisuke Seike、Nobuyuki Okahashi、Jun Ishii和Fumio Matsuda等人完成，主要作者来自日本大阪大学信息科学与技术研究科生物信息工程系及工业生物技术倡议部门。该研究成果于2023年发表于*Microbial Cell Factories*期刊，论文标题为“Improvement of ethanol and 2,3-butanediol production in Saccharomyces cerevisiae by ATP wasting”。

研究背景

酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）是生物乙醇生产的主要宿主，同时也可经代谢工程改造生产多种高附加值化学品，如2,3-丁二醇（2,3-butanediol，2,3-bdo）。2,3-BDO是一种重要的平台化学品，可用于合成橡胶前体、燃料添加剂、化妆品中间体等。然而，野生型酿酒酵母通常只积累少量2,3-BDO，生产强度较低。研究者此前构建了高产2,3-BDO的酿酒酵母菌株yhi030，该菌株虽然获得了较高的2,3-BDO产量，但葡萄糖消耗速率较慢，限制了生产效率。

已有研究发现，细胞中ATP的供给和消耗状态与发酵速率密切相关。在酿酒酵母中，乙醇合成与ATP再生是耦联的，增强ATP消耗或降低ATP合成可反馈激活糖酵解，从而促进葡萄糖消耗和乙醇生成。一个有效的策略是通过引入无效循环（futile cycle）人为增加ATP消耗，即利用酶促反应构成一个循环，不断水解ATP但不产生净代谢物。本研究的目的即是在乙醇生产菌株by318和2,3-BDO生产菌株yhi030中引入基于果糖-1,6-二磷酸酶（fructose-1,6-bisphosphatase，FBPase）和ATP合酶（ATPase）的无效循环，考察其对细胞生长、底物消耗和目标产物合成的影响。

研究内容与流程

研究选取了两株亲本菌株：s288c背景的实验室乙醇生产菌株by318和2,3-BDO生产菌株yhi030。yhi030是通过在丙酮酸脱羧酶缺陷型（pdcδ）菌株中表达来自植物乳杆菌的乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）、来自乳酸乳球菌的乙酰乳酸脱羧酶（acetolactate decarboxylase，ALDC）和来自酿酒酵母的丁二醇脱氢酶（butanediol dehydrogenase，BDH）所获得的。研究者分别构建了表达scefbpase（来源于酿酒酵母的FBPase）、ecofbpase（来源于大肠杆菌的FBPase）、opt_ecofbpase（针对酿酒酵母密码子优化的大肠杆菌FBPase）以及atpase（大肠杆菌F型ATP合酶的水解活性F1部分）的重组菌株。FBPase通过催化果糖-1,6-二磷酸（fructose 1,6-bisphosphate，FBP）水解为果糖-6-磷酸（fructose 6-phosphate，F6P）和磷酸根离子，而糖酵解中由果糖-6-磷酸生成FBP又需要消耗ATP，因此FBPase的异源表达可形成ATP水解的无效循环。大肠杆菌ATP合酶F1部分由α、β、γ亚基组成，在没有质子梯度时能把ATP水解为ADP和磷酸，从而单独强化ATP消耗。研究者采用2A肽段串联表达策略，将atpa、atpg和atpd基因分别通过GSG- ERBV-1和GSG- PTV-1序列连接，实现单条mRNA共翻译后自剪切，从而在酵母中实现多顺反子表达。

所有基因均通过pgk1强启动子在pgk426质粒上表达，并整合至by318和yhi030菌株。研究者首先在合成葡萄糖培养基（synthetic dextrose，sd）中进行摇瓶分批培养，通过测定od600监测细胞生长，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）定量葡萄糖、甘油、乙酸等代谢物，利用气相色谱（gas chromatography，GC）测定乙醇、2,3-BDO、乙偶姻（acetoin）等产物的浓度。通过绘制浓度随时间的变化并计算比消耗/生产速率来分析菌株的发酵性能。

在表型分析的基础上，研究者利用实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测了opt_ecofbpase和atpase在细胞中的转录水平，以验证异源基因的表达状况。代谢组学分析则用于检测ATP、ADP、AMP、NADH及其他中心碳代谢中间产物的变化，以揭示无效循环对细胞能量状态和代谢流的影响。具体地，细胞在特定时间点通过快速过滤收集，经甲醇-氯仿-水体系提取细胞内代谢物，并使用LC-MS/MS进行离子对液相色谱-串联质谱分析。

主要研究结果

在by318菌株中，表达opt_ecofbpase和atpase的细胞在培养25 h时乙醇浓度显著高于对照菌株，分别提高了8%和21%。但在最大菌体密度方面，by318-opt_ecofbpase和by318-atpase菌株分别较对照下降了15%和34%，表明ATP消耗抑制了细胞生长。比葡萄糖消耗速率在by318-opt_ecofbpase和by318-atpase菌株中分别增加了30%和42%，而比乙醇生产速率分别提高了24%和45%。值得注意的是，by318-atpase菌株的甘油最大浓度降低了48%，乙酸最大浓度降低了36%，表明细胞通过抑制甘油和乙酸合成以增强乙醇合成效率。by318-atpase菌株的甘油产率从0.138 mol/mol葡萄糖降至0.105 mol/mol葡萄糖，乙醇产率则从1.75 mol/mol葡萄糖上升至1.79 mol/mol葡萄糖。

在yhi030菌株中，atpase的引入使比葡萄糖消耗速率从0.920 mmol/g-dcw/h增加到1.06 mmol/g-dcw/h（约15%），比2,3-BDO生产速率从0.464 mmol/g-dcw/h增加到0.633 mmol/g-dcw/h（约36%），2,3-BDO产率从0.505 mol/mol葡萄糖提高到0.598 mol/mol葡萄糖（约18%）。2,3-BDO产量在持续培养168 h时可达到86.6 mM。Opt_ecofbpase的引入虽然使2,3-BDO产量增加26%，但比葡萄糖消耗速率却下降了14%，说明不同的无效循环对同一菌株产生的效应不完全一致。基因表达分析显示，atpase和opt_ecofbpase在mRNA水平均有明显上调，但基因表达水平与产物提高幅度不完全线性相关，提示蛋白质翻译、折叠和活性等可能也影响最终表型。

细胞内代谢组分析显示，by318-atpase菌株中的ATP浓度显著下降45%，而yhi030-opt_ecofbpase和yhi030-atpase菌株中的ATP水平分别下降36%和34%。这表明引入atpase或fbpase能有效降低细胞内ATP池，迫使细胞加快糖酵解以补偿能量赤字。NADH水平在by318-opt_ecofbpase和by318-atpase中显著降低，可能是由于乙醇合成加快，消耗更多NADH。Yhi030系列菌株的胞内3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸等后段糖酵解中间产物也减少，说明糖酵解代谢流增强。

结论与价值

本研究证明，在酿酒酵母中通过表达FBPase或F1-ATPase构建ATP无效循环可以增强乙醇和2,3-BDO的生产能力。具体而言，atpase在乙醇生产菌株by318中显著提高了葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率；在2,3-BDO生产菌株yhi030中同时提高了生产速率和产物得率。代谢组学数据进一步证实，这些改善与细胞内ATP浓度下降及糖酵解通量增加有关。

本研究的科学价值在于揭示了一种通过调控ATP供给来改变细胞代谢状态的通用策略。虽然已有研究表明ATP耗散能够提高代谢物生产，但本研究系统比较了不同来源FBPase和ATPase的效果，并在两种不同产物类型的菌株中验证了这一策略的适用性。应用层面，本研究为改进生物乙醇和2,3-BDO发酵效率提供了新的工程改造思路。尤其在工业酵母发酵中，适当增加ATP消耗可能有助于提高目标产物合成速率，但同时也需权衡细胞生长和生物量积累，因此未来可通过调控atpase表达强度或诱导时间以平衡生长和生产。

研究亮点

本研究的突出之处在于：其一，设计了两种不同机制的ATP耗散策略，即基于FBPase的底物循环和基于F1-ATPase的直接ATP水解；其二，在多株不同代谢背景的菌株中平行验证，揭示了无效循环对生长和产物合成的差异性影响；其三，结合发酵分析、基因表达检测和代谢组学分析，从多个层面解释了ATP耗散策略的作用机制。此外，通过2A串联序列实现ATP合酶多亚基共表达，解决了酵母中多顺反子表达的技术难点，具有方法学创新意义。