关于Panagiotakopoulou等人研究《嵌合人源类器官与小鼠脑片共培养系统用于研究小胶质细胞功能》的学术报告
一、 研究团队与发表信息 本研究由德国图宾根大学赫蒂临床脑研究所细胞神经学系的Vasiliki Panagiotakopoulou领衔，团队成员包括Marc Welzer、Olmo Ruiz Ormaechea、Diana Werner、Lena Erlebach、Anika Bühler、Ulrike Obermüller、Jonas J. Neher、Mathias Jucker和Deborah Kronenberg-Versteeg。作者单位还包括德国神经退行性疾病中心（DZNE）以及图宾根大学神经科学研究生培训中心。该项研究成果以报告（Report）形式于2025年12月23日发表在国际知名期刊《细胞报告》（Cell Reports）上，文章标题为“嵌合人源类器官与小鼠脑片共培养系统用于研究小胶质细胞功能”。
二、 研究背景与目的 本研究属于神经科学，特别是神经免疫学与脑类器官模型交叉领域。研究的核心动机源于在体外精准模拟和解析人类小胶质细胞在脑发育及神经退行性疾病中动态功能的迫切需求。小胶质细胞是大脑中主要的免疫细胞，其表型和功能高度依赖于组织微环境提供的复杂信号。然而，目前的研究模型存在显著局限：传统小鼠模型存在物种间转录组和年龄相关的差异；而利用人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）在体外分化的小胶质细胞（iPSC-derived microglia, iMics），虽能重现部分形态和功能，但其基因表达谱与体内真实的人类小胶质细胞仍有差距，这为针对小胶质细胞的治疗策略测试带来了挑战。近年来，将hiPSC来源的类器官（human organoids, HOrgs）移植到小鼠脑内的异种移植技术，虽能显著提升小胶质细胞的成熟度，使其更接近脑源性人类小胶质细胞，但该技术面临操作复杂、成本高昂及伦理问题。
因此，本研究旨在开发一种互补性的体外（in vitro）模型，以弥补简化单培养与复杂体内（in vivo）系统之间的鸿沟。具体研究目标是：建立一个能够长期维持、并在结构化、类脑环境中研究人类小胶质细胞的体外平台。该系统应能支持小胶质细胞的成熟、存活、功能发挥，并可用于研究其与神经元的相互作用以及对病理刺激（如β-淀粉样蛋白）的反应。
三、 详细研究流程与方法 本研究构建并验证了一种创新的“嵌合共培养系统”，其核心是将hiPSC来源的脑类器官（HOrg）与小鼠脑片培养物（mouse brain slice cultures, MBSCs）在气液界面条件下进行长期共培养。整个研究流程包含多个严谨的步骤，涉及多种细胞类型、复杂的实验操作和数据分析。
1. 研究对象的制备与培养条件设定 * 人源脑类器官（HOrg）的生成：研究使用了三种不同的hiPSC细胞系（Kolf2.1J, Bioni010-C, Bioni037-A），采用基于悬浮培养的标准化方案进行分化，生成具有神经上皮特征的脑类器官。实验中选用发育第21天的类器官进行共培养，模拟人类小胶质细胞前体在体内进入大脑的早期发育阶段。 * 小鼠脑片培养物（MBSC）的制备：从出生后第4-6天的C57BL/6J小鼠幼崽中分离海马组织，将其切割成350微米厚的切片，置于多孔膜插入物上进行气液界面培养。培养液含有高浓度葡萄糖和20%马血清，以支持脑片组织的长期存活。 * 人源小胶质细胞（iMics）的预分化：使用相同的hiPSC系，通过形成拟胚体并在含特定细胞因子（如CSF1、IL-3）的培养基中分化，生成小胶质细胞前体。
2. 核心实验流程与操作 * 嵌合共培养系统的建立：将单个21天龄的HOrg直接置于预培养的MBSC上，使其紧密接触，在气液界面条件下进行共培养。该操作本身即构成一种新颖的实验体系搭建。 * 小胶质细胞整合实验设计：为了研究小胶质细胞的迁移和整合，设计了两种对比条件： * 对照组：HOrg与含有内源性小鼠小胶质细胞的MBSC共培养。 * 实验组：首先使用抗CSF1R抗体清除MBSC中的内源性小鼠小胶质细胞，然后将hiPSC来源的iMics前体细胞“滴种”到清除后的MBSC上，使其在MBSC环境中预分化10天。随后，再将这个“载有人类小胶质细胞”的MBSC与HOrg进行共培养。 * 对照条件：将iMics直接接种到单独培养的HOrg上，作为基准对照。 * 长期培养与时间点分析：共培养体系维持数周至数月（最长可达12个月）。研究者在共培养后的第1、2、3、4周以及更长时间点（如5个月、12个月）定期收集样本进行分析。 * 功能与病理学响应测试： * 稳态监视与损伤响应：对长期共培养体系进行多光子活细胞延时成像，观察小胶质细胞在稳态下的伪足动态运动。并使用激光在特定区域诱导局灶性损伤，实时记录小胶质细胞向损伤部位延伸过程的响应速度和模式。 * β-淀粉样蛋白病理响应：将阿尔茨海默病转基因小鼠（APP23）脑组织匀浆作为“种子”以及合成的Aβ肽段添加到共培养体系中，诱导β-淀粉样蛋白聚集形成斑块。该实验使用了携带野生型TREM2基因或阿尔茨海默病风险等位基因R47H突变型TREM2的hiPSC来源的小胶质细胞，以研究基因型依赖性的斑块反应。
3. 分析方法与关键技术 * 形态学与免疫荧光分析：这是评估结构整合、细胞迁移、形态和标记物表达的主要手段。通过免疫荧光染色标记特定蛋白，例如：用Iba1标记小胶质细胞，用MAP2、TBR1、CTIP2标记神经元（特别是皮层神经元），用GFAP标记星形胶质细胞，用STEM121/101区分人鼠细胞。使用共聚焦显微镜获取高分辨率图像。 * 分子生物学分析： * 实时定量PCR（RT-qPCR）：用于定量分析HOrg中神经元标记物（如TBR1, MAP2, NEUN, SYP, SATB2）、神经前体标记物（如Nestin, BRN2）以及小胶质细胞标记物的mRNA表达水平变化。 * 酶联免疫吸附试验（ELISA）：定量检测共培养上清液中人源集落刺激因子1（human CSF1, hCSF1）的浓度，探究潜在的趋化因子机制。 * 活细胞成像与定量分析：利用双光子显微镜进行长时间序列成像。采用ImageJ（Fiji）软件及其插件进行定量分析： * 使用TrackMate插件追踪单个小胶质细胞的运动轨迹，计算平均速度。 * 使用Radial Profile插件分析激光损伤后，小胶质细胞荧光强度随与损伤核心距离变化的曲线，量化其招募反应。 * 淀粉样斑块形态分析：使用发光共轭寡聚噻吩染料进行染色，并通过光谱分析其发射光谱比率（QFtaA/HFtaA），以评估斑块的致密程度。
四、 主要研究结果及其逻辑关联 本研究获得了一系列系统性的重要发现，结果之间环环相扣，逐步揭示了嵌合共培养系统的优势和作用机制。
1. HOrg与MBSC之间建立了持续的结构与细胞相互作用。 共培养24小时内，两者即发生物理粘附。一周后，HOrg中的人类神经元开始向MBSC发出轴突投射；两周后，形成了密集的轴突束并广泛延伸至MBSC内部及周围。同时，MBSC中的星形胶质细胞也伸出突起朝向HOrg组织。免疫染色证实，两种组织中的少突胶质细胞谱系细胞分别保持其物种来源，没有发生明显的混杂。这一结果首先证明了该共培养体系能成功建立异种组织间的结构性连接，为后续的细胞迁移和信号交流提供了物理基础。
2. 人类小胶质细胞在嵌合共培养中优先迁移进入HOrg。 这是本研究的关键发现之一。在长达4周的观察中，内源性小鼠小胶质细胞向HOrg的迁移非常有限。与之形成鲜明对比的是，预先在MBSC中分化的人源iMics表现出了强大的、随时间显著增加的向HOrg迁移的能力。定量分析显示，人源iMics在HOrg中所占的IBA1阳性面积比例持续上升。这一结果强烈提示，人类小胶质细胞对人类神经组织来源的线索具有特异性偏好，凸显了微环境信号的物种特异性。
3. 嵌合共培养促进小胶质细胞分枝化及稳态形态的维持。 形态学分析显示，直接接种在HOrg上的iMics在4周后多数仍保持阿米巴样（活化/未成熟态），分枝有限。而在HOrg-MBSC共培养体系中的iMics，则呈现出高度分枝、具有 surveilling形态的稳态表型，其细胞胞体面积更小，初级突起数量更多，突起长度更长。更重要的是，在仅HOrg培养条件下，小胶质细胞数量在6周内急剧下降并几乎消失；而在共培养条件下，尽管样本间细胞数量存在波动，但小胶质细胞能维持分枝化形态，并在多数培养物中存活并保持活性长达12个月。这一结果直接将共培养环境与小胶质细胞的长期存活和功能成熟联系起来。
4. 长期存活的人类小胶质细胞在体外表现出监视及损伤响应功能。 活细胞成像提供了功能的直接证据。在长达12个月的共培养物中，稳态的小胶质细胞表现出活跃的伪足动态运动，平均速度约为0.0284微米/秒。当发生激光诱导的局灶损伤时，共培养系统中的iMics能迅速伸出伪足向损伤核心聚集，而单独HOrg培养条件下的iMics则无此反应。荧光强度定量分析证实了其向损伤部位的局部招募。这些功能测试证明，该模型不仅能维持细胞存活，还能支持其执行关键的生理功能。
5. MBSC共培养增强了HOrg中皮层神经元标记物的表达。 研究发现，即使在没有iMics的情况下，与MBSC共培养也能显著改变HOrg的发育轨迹。免疫荧光和RT-qPCR结果显示，与单独培养的HOrg相比，共培养的HOrg更早（2-3周）且更强烈地表达皮层神经元标记物CTIP2和TBR1，同时神经元总标记物MAP2的表达面积也更大。RT-qPCR进一步表明，神经元标记物（TBR1, MAP2等）的表达在早期时间点（2、4周）有升高趋势，而神经前体标记物（Nestin, BRN2）的水平下降更快。这表明MBSC提供了一个支持性微环境，促进了HOrg的皮层分化和/或特定神经元的成熟，这种更成熟的神经环境可能反过来有利于小胶质细胞的整合与存活。
6. 嵌合共培养诱导人源CSF1释放，可能支持小胶质细胞整合。 机制探索发现，在含有iMics的HOrg-MBSC共培养物的培养基中，人源CSF1的浓度随培养时间逐渐增加，而在标准的单独类器官培养条件下，hCSF1在整个4周内都检测不到。CSF1是小胶质细胞生存和发展的关键因子。这一相关性发现提示，共培养环境可能通过增强细胞间信号交流，促进了hCSF1等支持性因子的释放，从而驱动了小胶质细胞向HOrg环境的迁移和定植。
7. 共培养系统可用于研究基因型依赖的小胶质细胞对Aβ病理的反应。 初步探索性实验表明，该平台能够支持Aβ斑块的形成。当使用携带TREM2 R47H突变（AD风险基因）的iMics时，观察到其与Aβ斑块的共定位倾向低于野生型iMics，这与体内研究结果一致。光谱分析还提示，R47H突变型小胶质细胞存在下的斑块形态可能更松散。这为在可控的遗传背景下研究人类小胶质细胞在神经退行性病理中的作用提供了概念验证。
五、 研究结论、意义与价值 本研究成功开发并验证了一种新型的“嵌合人源类器官-小鼠脑片共培养系统”，作为研究人类小胶质细胞长期功能的强大体外平台。其科学价值与应用前景体现在以下几个方面：
六、 研究亮点 1. 创新性的共培养体系：首次将人源脑类器官与小鼠脑片在气液界面下长期共培养，创造了一个高度结构化、支持细胞互作的体外“类脑”生态位。 2. 关键发现：明确揭示了人类小胶质细胞在嵌合环境中的特异性优先迁移行为，以及该环境对其稳态形态维持和长期功能（监视、损伤响应）的支持作用。 3. 双向互益效应：不仅关注小胶质细胞在类器官中的行为，还发现共培养能显著促进类器官本身的皮层神经元分化，表明系统内存在双向的、促进成熟的信号交流。 4. 强大的实用性与扩展性：模型支持长达数月至一年的研究，并已成功应用于功能测试（激光损伤）和初步病理模型（Aβ斑块），证明了其作为基础研究与转化应用平台的广泛潜力。
七、 其他有价值内容 研究在讨论部分也坦诚地指出了当前模型的局限性，如缺乏功能性血管系统、脑片培养条件非完全生理性、存在样本间变异性、尚未证实组织间的功能性电信号沟通、以及缺乏对小胶质细胞的转录组学深度表征等。这些自我剖析为后续研究的改进方向（如引入单细胞RNA测序、空间转录组、电生理学技术等）提供了清晰的路线图。此外，研究声明在文稿撰写中使用了ChatGPT-4进行语言润色，但作者对内容全权负责，这也反映了当前AI工具在科研写作中的辅助作用。