基于传统中草药的天然小分子无载体自组装库研究学术报告
一、 作者、机构与发表信息
本研究由北京中医药大学中药学院的王小林、黄雪梅、田雪浩、袁志华、卢继辉、聂雪强、王鹏利、雷海民和王鹏龙*共同完成。通讯作者为王鹏龙。该研究以“Natural Small-Molecule-Based Carrier-Free Self-Assembly Library Originated from Traditional Chinese Herbal Medicine”为题，发表于美国化学会旗下期刊 ACS Omega 2022年第7卷第43510–43521页，在线发表日期为2022年11月20日。
二、 学术背景与研究目的
本研究的核心科学领域是超分子化学与纳米药物递送系统，特别是天然小分子的自组装（Self-Assembly）行为。超分子自组装是指两个或多个分子通过非共价键相互作用，自发形成具有特定微观结构和宏观特性的有序聚集体的过程。该技术在抗癌、疾病诊断、靶向给药等纳米医学领域展现出巨大潜力。然而，传统的小分子自组装体系的发现往往具有随机性，制备过程也可能较为复杂、成本较高，且组装体的结构和功能易受溶剂、pH值等外部理化因素影响。
另一方面，传统中药汤剂是一个成分极其复杂的天然化合物库。近年来，研究者已在多个经典复方汤剂（如麻杏石甘汤、血府逐瘀汤、三黄泻心汤等）以及单味药煎煮液（如黄连煎液）中发现了纳米颗粒的存在，这些纳米颗粒具有良好的稳定性和生物利用度。研究表明，这些纳米颗粒是汤剂中多种小分子活性成分通过相互作用自发组装形成的。因此，中药汤剂可以被视为一个天然的、无载体的小分子自组装库（Self-Assembly Library），有望为理性设计和发现新型自组装纳米材料提供新的思路和“绿色”策略，减少传统方法中的盲目性和偶然性。
本研究选取了在临床上已有数千年配伍使用历史的经典药对——大黄与黄连作为研究对象。在煎煮过程中，该药对汤液会出现明显的浑浊现象。课题组前期研究曾在大黄-黄连药对中发现了大黄酸-小檗碱纳米颗粒。本研究的目的是：从大黄与黄连共煎过程中产生的纳米聚集体出发，系统揭示其中存在的天然小分子无载体自组装现象。具体目标包括：1) 分离并表征共煎液中的超分子纳米颗粒；2) 全面分析其化学成分组成；3) 探索其形成机制，特别是验证并研究其中关键成分对的自组装行为与机理。
三、 详细研究流程
本研究是一个多技术手段联用的系统性探索，主要包含以下几个关键流程：
流程一：药对共煎液及其超分子组分的制备与初步表征 研究首先按照大黄:黄连 = 1:1的重量比进行常规水煎煮，过滤得到共煎液。将共煎液在80,000 rpm转速下超速离心30分钟，分别收集上清液和沉淀（即超分子部分）。所有样品均进行冷冻干燥以备后续分析。通过动态光散射（DLS）测量粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位，并通过丁达尔效应和扫描电子显微镜（SEM）观察溶液性质和微观形貌。结果显示，原始共煎液呈浑浊状，DLS显示其为一个尺寸约341.2 nm、分布均一且稳定的体系，Zeta电位为-27.0 mV，有明显的丁达尔效应。SEM观察证实其含有大量300-500 nm的球形纳米颗粒。离心后，上清液的丁达尔效应显著减弱，颗粒分布离散；而重新分散的超分子部分则呈现出均匀分散、尺寸约300 nm的纳米球，且具有显著的丁达尔效应和负的Zeta电位（-27.8 mV）。这表明共煎液中的纳米颗粒主要富集在超分子沉淀部分。
流程二：超分子组分化学成分的全面鉴定 为明确参与自组装的物质基础，研究采用超高效液相色谱-串联质谱联用技术（UPLC-MS/MS） 对超分子部分进行了系统的化学成分分析。使用C18色谱柱，以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，分别在正、负离子电喷雾电离（ESI+/-）模式下采集质谱数据。通过与文献报道的裂解规律对比以及数据库检索，研究者从超分子部分总共鉴定出119种植物化学物质。这些成分包括：23种蒽醌类（如大黄酸、大黄素）、31种生物碱类（如小檗碱、黄连碱）、24种有机酸、8种单宁（如儿茶素没食子酸酯），以及黄酮、氨基酸、单糖/多糖等其他成分。值得注意的是，通过对比超分子部分与上清液的总离子流色谱图（特别是负离子模式），发现蒽醌类和单宁类成分在超分子部分的含量远高于上清液。例如，大黄酸、大黄素、3-甲基大黄酸及儿茶素没食子酸酯在超分子部分的含量占比高达80%-90%。这一结果强烈暗示，在煎煮过程中，大黄和黄连的成分发生了相互作用，其产物主要存在于超分子聚集体中。
流程三：药对相互作用的热力学分析 为了从热力学角度证实大黄与黄连成分间的相互作用是化学驱动的自组装过程，而非简单的物理沉淀，研究采用了等温滴定量热法（ITC）。实验将黄连单煎液滴加到含有大黄单煎液的样品池中，并以黄连单煎液滴加至去离子水作为对照。ITC结果显示，黄连滴加大黄的过程产生向上的放热峰，拟合曲线呈典型的S形，表明这是一个彻底的化学反应。热力学参数计算得出：结合常数Ka为4.885×10³，吉布斯自由能变ΔG为-23.713 kJ/mol (<0)，焓变ΔH为-52.64 kJ/mol (<0)，熵变ΔS为-105.9 J/mol (<0)。由于|ΔH| > |-TΔS|，表明该反应是一个由焓驱动的自发过程。这证实了大黄与黄连活性成分之间通过氢键、静电吸引等非共价键发生相互作用并组装，而非简单的物理聚集。
流程四：关键成分对自组装体的构建与表征 基于化学成分分析结果，研究选取了在超分子部分高度富集的关键成分进行深入研究。具体而言，选择大黄的代表性蒽醌成分大黄酸和大黄素，以及黄连的代表性生物碱成分黄连碱，分别构建了二元自组装体系。 1. 制备方法：精确称量黄连碱氯化物和蒽醌成分（大黄酸或大黄素），分别溶于甲醇和DMSO。混合两种溶液并搅拌，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.5。随后将该混合液逐滴加入60°C的磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分搅拌并水浴超声1小时。最后将反应液转入截留分子量为3000 Da的透析袋中透析12小时以除去未反应的原料和有机溶剂，冻干透析袋内液即得自组装体：大黄酸-黄连碱纳米纤维和大黄素-黄连碱纳米颗粒。 2. 形貌表征：SEM观察显示，大黄素-黄连碱组装体形成尺寸为50-100 nm、分散均匀的球形纳米颗粒；而大黄酸-黄连碱组装体则呈现出纤维网状结构，纤维宽度约100 nm。这一发现不仅揭示了不同成分对可组装成截然不同的纳米形貌，也印证了药对共煎液中观察到的纳米球可能源自类似大黄素-黄连碱的组装过程。
流程五：自组装机制的多光谱学与热力学解析 为深入揭示自组装的驱动力和分子间相互作用机制，研究综合利用了多种光谱技术和ITC对两个模型组装体进行了分析。 1. ITC分析：对大黄素滴定黄连碱、大黄酸滴定黄连碱的过程进行ITC测试。结果显示两者均为放热反应，吉布斯自由能变ΔG分别为-22.61 kJ/mol和-27.59 kJ/mol，且均为|ΔH| > |-TΔS|的焓驱动自发过程。这与全药对煎液的ITC结果一致，进一步证明模型组装体的形成是化学驱动的。 2. 紫外-可见吸收光谱分析：对比单体与组装体的紫外谱图发现，组装体兼具单体成分的特征吸收峰，但部分峰发生了蓝移或红移。例如，Rhe-Cop NFs在434 nm处的特征峰相对于黄连碱单体的462 nm发生了蓝移。这表明分子间的弱相互作用影响了分子内电子的π-π*和n-σ*跃迁。 3. 傅里叶变换红外光谱分析：FT-IR谱图显示，在组装体中，大黄酸的羧基（COOH）的O-H伸缩振动峰向高波数移动，C=O伸缩振动峰从1690 cm⁻¹移至1663 cm⁻¹且强度减弱；黄连碱芳香环骨架振动峰（1504 cm⁻¹）的波数和强度也发生变化。大黄素的3-OH伸缩振动峰（3386 cm⁻¹）在组装后消失，其醌环C=O峰发生位移和强度变化。这些变化表明，在组装过程中存在氢键和π-π堆积相互作用。 4. 核磁共振氢谱分析：¹H NMR提供了分子水平相互作用的直接证据。结果显示，在大黄酸-黄连碱和大黄素-黄连碱组装体中，蒽醌成分的3-COOH或3-OH的质子信号消失，表明这些基团与黄连碱的季铵氮原子之间可能发生了静电吸引。同时，蒽醌环上的1,8-OH质子信号向低场移动，表明蒽醌分子间存在氢键，形成了层状骨架结构。此外，黄连碱苯基异喹啉环上的多个芳香质子信号向高场移动了0.04-0.11 ppm，这明确提示了蒽醌层与黄连碱分子之间存在着π-π堆积作用。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究的各个流程环环相扣，结果相互印证，最终系统地证实了从传统中药煎煮液中发现和解析天然小分子自组装现象的可行性与科学性。 1. 初步表征与成分鉴定：首先通过DLS、SEM证实了大黄-黄连共煎液中存在稳定的、尺寸均一的球形纳米颗粒，且这些颗粒富集于超分子沉淀中。随后，UPLC-MS/MS鉴定出119种成分，并发现蒽醌和单宁在超分子部分高度富集。这一结果提出了关键科学问题：这些纳米颗粒是哪些成分、通过何种相互作用形成的？ 2. 热力学与模型验证：ITC对全药对煎液的分析回答了相互作用性质的问题，证明其为焓驱动的自发化学过程，排除了物理沉淀的可能。基于成分富集信息，研究者逻辑地选取了关键成分对（大黄酸/大黄素 vs. 黄连碱）进行模型组装研究，成功制备出形貌不同的纳米颗粒和纳米纤维，直观再现了煎煮液中可能发生的自组装行为。 3. 机制深度解析：对模型组装体的ITC分析确认其自发性与全药对一致。UV-vis、FT-IR和¹H NMR的联合分析则层层深入地揭示了自组装的具体驱动力：静电吸引（蒽醌的羧基/酚氧负离子与生物碱的季铵正离子）、氢键（蒽醌分子间及与生物碱间）和π-π堆积（芳香环体系之间）。¹H NMR的化学位移变化尤为关键，直接指认了相互作用发生的位点。 整个研究流程从宏观现象（煎液浑浊、纳米颗粒）出发，到组分分析（化学成分鉴定），再到模型构建与微观机制阐释（相互作用力），形成了一个完整、严谨的证据链。
五、 研究结论与价值意义
本研究得出以下核心结论： 1. 在大黄与黄连的共煎液中，存在由多种植物化学成分通过自发相互作用形成的球形超分子纳米颗粒。 2. 共煎液中的自组装是一个由焓驱动的自发化学过程，主要由活性成分间的非共价键相互作用介导。 3. 大黄的主要成分大黄素和黄连碱可自组装形成约50 nm的纳米颗粒，而大黄酸和黄连碱则组装成纳米纤维。 4. 这些二元自组装体的形成机制主要涉及静电吸引、氢键和π-π堆积的协同作用。
本研究的科学价值与应用意义在于： * 方法论创新：为从复杂天然产物体系（尤其是中药复方）中发现新型无载体自组装纳米材料提供了一套可行的研究范式。这种“从汤剂中发现”的策略，相较于传统的理性设计或随机筛选，更具方向性和系统性，且源于天然，符合绿色化学理念。 * 理论认识深化：首次系统揭示了大黄-黄连这一经典药对在纳米尺度的相互作用形式，从一个全新的物态角度阐释了中药配伍的“物质基础”，为理解中药复方多成分协同作用的复杂性和整体性提供了新的视角。 * 应用潜力：所发现的天然小分子自组装体（如Emo-Cop NPs, Rhe-Cop NFs）本身即为具有明确组成和结构的纳米材料，无需额外载体，在药物递送、抗菌、抗炎等领域具有直接的应用潜力。此外，该研究也为未来设计基于天然小分子的二元或多元自组装体系提供了重要参考。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究中提及，除了小分子相互作用，中药煎液中的多糖和蛋白质成分也被发现可以自组装并表现出良好的生物活性。这提示中药汤剂中的自组装是一个多层次、多类型的复杂系统，未来研究可以进一步拓展到糖类、蛋白等大分子组分及其与小分子的共组装，以更全面地揭示中药煎煮过程中形成的“纳米汤”的完整图景及其与药效的关联。此外，文中引证的多个已发现纳米颗粒的复方（如泻心汤、白虎汤等），也说明了从中药中发掘自组装材料这一领域的广阔前景。